MIQE指南——RT-qPCR中的RNA質(zhì)量控制

1. 如何對污染進(jìn)行監(jiān)測？

RNA質(zhì)量控制分為三個(gè)部分，一是濃度，二是純度，三是完整性。對于基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)來說，了解物質(zhì)的起始濃度是很重要的。在比較來自不同樣本的結(jié)果時(shí)，應(yīng)使用相同的樣本量。此外，確定材料的起始濃度也可以對后續(xù)的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行優(yōu)化。樣本可能會被蛋白質(zhì)、基因組DNA或其他有機(jī)化合物污染。這種污染可能會影響RNA的量化，同時(shí)下游應(yīng)用及其結(jié)果的相關(guān)性也可能受到這種污染的影響�；�因組DNA、DNA結(jié)合蛋白、酚類化合物或在RNA提取過程中引入的外源性顆粒（如手套中的粉末），已被證明可以抑制下游逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增步驟。與DNA相比，RNA是一種相對不穩(wěn)定的分子。因此，RNA的完整性是RNA樣本整體質(zhì)量的重要組成部分。為了避免降解，RNA樣本必須小心地保存，或者在非常低的溫度下沉淀或者最好是凍干。

為了比較基因表達(dá)數(shù)據(jù)，必須使用可靠的標(biāo)準(zhǔn)化方法。MIQE指南強(qiáng)調(diào)，所提供的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)包括儀器信息、RNA提取方法以及RNA樣本的濃度、純度和完整性。高質(zhì)量的RNA應(yīng)當(dāng)避免RNA酶的污染，勤換手套，使用無RNA酶的試劑和耗材，使用專門的無RNA酶設(shè)備用于提取，設(shè)立PCR前和PCR后的實(shí)驗(yàn)分區(qū)。取樣時(shí)盡可能縮短取樣時(shí)間，于液氮中快速冷凍，加入適量的裂解緩沖液和RNA保護(hù)劑。在RNA提取時(shí)，確保組織在裂解過程中是冷凍狀態(tài)，并使用RNA酶抑制劑。提取的RNA在適宜條件下存儲，-80℃可長期保存，避免反復(fù)凍融。如何明確用于RT-qPCR檢測的RNA是否合格？接下來給大家詳細(xì)介紹一下RNA質(zhì)控的具體方法。

2. 總RNA質(zhì)量控制方法

RNA質(zhì)量控制可以多種方法進(jìn)行，它們適用性也各不相同。

分光光度計(jì)

總RNA可以利用紫外光的強(qiáng)吸附特性使用核酸分光光度計(jì)進(jìn)行定量，但缺陷是這種紫外光譜方法并不能區(qū)分不同類型的核酸，因此最常見的污染物如基因組DNA可能會顯著影響測定結(jié)果。為了更精確的RNA定量，污染的基因組DNA必須被DNA酶消化去除。游離核酸也有助于增加在260nm處的吸收，因此可能需要在DNA酶處理后進(jìn)一步純化總RNA。通過測定樣品的OD值去評估RNA純度，OD260/280在1.9-2.1之間的樣本純度較好，當(dāng)OD值小于1.9，說明有蛋白質(zhì)殘留，OD值大于2.1說明RNA可能發(fā)生降解。該方法適用于測定總RNA的濃度和純度；然而，這種方法不能提供任何關(guān)于RNA完整性相關(guān)的信息。

熒光染料測定

另一種評估RNA濃度的高靈敏度方法是測量與RNA結(jié)合并在結(jié)合時(shí)發(fā)出選擇性熒光染料的熒光強(qiáng)度，例如RiboGreen®。染色后的樣品可以用熒光計(jì)在試管或微孔板上進(jìn)行定量�；�因組DNA殘留會影響測定結(jié)果，因此為了更準(zhǔn)確的RNA定量，用DNA酶處理是必要的。此外，基于熒光染料的總RNA定量只測量聚合的核酸，而不會檢測到受污染的蛋白質(zhì)和游離的核糖核苷酸。這種敏感的方法對RNA豐度非常低的樣本非常有用。MIQE的RNA定量指南推薦采用基于熒光的檢測方法。然而，它只適用于總RNA的定量，并不能提供關(guān)于RNA的純度和完整性的相關(guān)信息。

3'：5'完整性分析

以GAPDH作為目標(biāo)序列的 3'：5'檢測已被提出作為mRNA完整性的替代測量方法。在GAPDH mRNA序列的三個(gè)單獨(dú)的qPCR檢測中，GAPDH mRNA序列的5'端、中間和3'端區(qū)域均有目標(biāo)擴(kuò)增子。所描述的三重檢測使用TaqMan®化學(xué)方法進(jìn)行，每個(gè)擴(kuò)增子均由靶標(biāo)特異性差異標(biāo)記的探針檢測。3'：5'比率描述了3'端和5'端的信號強(qiáng)度的比較。這個(gè)值反映了mRNA模板的完整性。3'：5'的比值約為1表示mRNA完整性高，而值大于5表示mRNA降解。所獲得的數(shù)據(jù)獨(dú)立于核糖體RNA的完整性，并提供了mRNA降解的可量化測量方法。這種分析方法特別適用于在RNA很少時(shí)珍貴樣本的分析。

瓊脂糖凝膠電泳

瓊脂糖凝膠電泳被廣泛應(yīng)用于核酸片段的定性分析。它是一種基于凝膠的技術(shù)，提供基于大小和電荷的核酸分子分離范圍。在RNA電泳過程中，帶負(fù)電荷的RNA通過凝膠向陽極遷移。簡單地說，一個(gè)RNA分子的長度決定了它的遷移時(shí)間。然而，通過分子內(nèi)堿基配對形成RNA的二級結(jié)構(gòu)可能會延遲遷移，因此，建議在變性條件下進(jìn)行RNA電泳。在瓊脂糖凝膠上分離的總RNA顯示出特有的物種特異性條帶模式。通常，在真核生物中，可以檢測到包含28S和18S核糖體RNA（rRNA）的兩條主要條帶。當(dāng)28S:18S rRNA比值為2或更高時(shí)，我們認(rèn)為總RNA是高質(zhì)量的。瓊脂糖凝膠電泳相對便宜，容易獲得，然而，由于缺乏標(biāo)準(zhǔn)化和客觀性，MIQE指南不推薦使用瓊脂糖凝膠電泳。此外，瓊脂糖凝膠電泳需要大量寶貴的RNA樣本，涉及危險(xiǎn)化學(xué)品的處理，并不提供RNA定量的相關(guān)信息。

毛細(xì)管電泳

毛細(xì)管電泳可用于分離和量化RNA樣本。與經(jīng)典的凝膠電泳相比，這種電泳模式顯著減少了不同類型核酸的分離時(shí)間以及試劑和樣品的消耗。毛細(xì)管電泳可以提供RNA完整性和濃度的分析。RT-qPCR的性能受RNA完整性的影響，而PCR的效率一般不受影響。測定后RIN值大于5的總RNA被認(rèn)為是質(zhì)量良好，RIN值大于8的被認(rèn)為是完整的總RNA。不同生物體和特定樣本類型有特定RIN值要求和閾值水平。作為一種方便和客觀的評估RNA數(shù)量和完整性的方法，該方法與MIQE指南理念完全一致，因此經(jīng)常被推薦用于總RNA質(zhì)量控制。

3. miRNA質(zhì)量控制方法

RNA質(zhì)量的測定也應(yīng)用于其他方面，如microRNA（miRNA）表達(dá)譜分析。傳統(tǒng)的分光光度法不適用于測定這些短的、非編碼的RNA分子的濃度。RNA提取方法對于保留miRNA和小RNA組分是至關(guān)重要的。由于miRNA和小RNA的遷移類似于降解的總RNA，高濃度的這些物種類型可能因此產(chǎn)生低于預(yù)期的RIN值。RIN閾值的確定可能需要根據(jù)特定的提取方法進(jìn)行調(diào)整。

4. 總結(jié)

在開展RT-qPCR和轉(zhuǎn)錄組測序等這種通過測定RNA轉(zhuǎn)錄水平來評估基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)時(shí)，我們需要對樣本的總RNA質(zhì)量進(jìn)行嚴(yán)格把控。通過多種方法的結(jié)合，檢測出可用于下游實(shí)驗(yàn)的RNA，樣本質(zhì)量質(zhì)控通過后，后續(xù)的基因表達(dá)分析才是有意義的。