293T細(xì)胞培養(yǎng)過程中傳代后聚團(tuán)嚴(yán)重及貼壁性問題的原因分析

293 [HEK-293] 細(xì)胞是經(jīng)人腺病毒5(Ad5)轉(zhuǎn)染而形成的人胚腎細(xì)胞永生化細(xì)胞系，293細(xì)胞包含并表達(dá)轉(zhuǎn)染的Ad5基因。293T細(xì)胞是293 [HEK-293] 細(xì)胞株插入了SV40 T-antigen的溫度敏感基因形成的高轉(zhuǎn)衍生株，廣泛用于病毒包裝，呈上皮樣，貼壁，營(yíng)養(yǎng)體系是DMEM+10% FBS。

表1 293T細(xì)胞基本信息

圖1 293T [HEK-293T] （人胚腎細(xì)胞）
 

一、首先我們討論的是為啥293T細(xì)胞傳代后聚團(tuán)嚴(yán)重？如圖2所示，背景貼壁細(xì)胞貼壁良好，形態(tài)正常，而黃色團(tuán)塊則是因?yàn)?span style="color:rgb(35, 111, 161)">消化不當(dāng)形成的細(xì)胞團(tuán)，難以貼壁，并出現(xiàn)了成簇增殖。
 

圖2 293T [HEK-293T] （人胚腎細(xì)胞）
 

這種情況多半是胰酶消化操作不當(dāng)導(dǎo)致的細(xì)胞聚團(tuán)：

1）消化過度或吹打過猛導(dǎo)致細(xì)胞受傷嚴(yán)重，破損的細(xì)胞碎片容易粘連聚團(tuán)；

2）消化時(shí)細(xì)胞融合率太高，成片脫落，將不容易被吹散，容易聚團(tuán)。

解決細(xì)胞消化不當(dāng)，要考慮細(xì)胞的生長(zhǎng)特性，鑒于該細(xì)胞貼壁疏松，普通0.25%胰酶消化時(shí)間控制在15s-30s；吹打動(dòng)作輕柔，控制在10-20次；細(xì)胞融合率達(dá)到80%傳代即可傳代。

二、接下來咱們要討論的是為啥293T換了血清批次后聚團(tuán)嚴(yán)重？如圖3所示，換血清批次后嚴(yán)重聚團(tuán)的293T細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)難以分辨，黏附在一起。
 

導(dǎo)致細(xì)胞聚團(tuán)的因素很多，其一是血清批間差導(dǎo)致細(xì)胞聚團(tuán)。

血清來源于動(dòng)物，其組成成分有1000種左右，且血清組成及含量常隨供血?jiǎng)游锏哪挲g、生理?xiàng)l件和營(yíng)養(yǎng)條件而異。每個(gè)批號(hào)的組分百分比含量都是不固定的，所以批間差異是存在的。293T細(xì)胞本身有聚團(tuán)生長(zhǎng)特性，但嚴(yán)重聚團(tuán)可能受到血清里的某些因子刺激。
 

圖3 換血清批次后嚴(yán)重聚團(tuán)的293T細(xì)胞
 

如何有效地預(yù)防血清批間差呢？可以通過先用血清試用裝，試用效果好，可購買和血清試用裝批次相同的正裝，囤積半年或一年的用量，有效避免批間差對(duì)細(xì)胞的影響（胎牛血清在-20℃保存可達(dá)5年）。
 

三、接下來我們要討論的是293T細(xì)胞貼壁性問題。通常有兩種情況，

第一種情況是為啥用了新批號(hào)的血清，細(xì)胞貼壁性變差？如圖4所示，貼壁疏松的293T細(xì)胞。
 

圖4 貼壁疏松的293T細(xì)胞
 

這種情況大概率是血清存在批間差異，而293T細(xì)胞本身特點(diǎn)就是貼壁性差，對(duì)不同批次的血清適應(yīng)性不同，就容易出現(xiàn)貼壁疏松現(xiàn)象�？蛇m當(dāng)加高血清比例（最高不超過20%）；建議試好一個(gè)血清批次多屯一些，可以避免血清批間差對(duì)細(xì)胞的影響。

第二種情況是為啥293T細(xì)胞從瓶里（例如T25）鋪板到孔里（96孔板），貼壁性變差？這種情況排除掉瓶和孔板本身材質(zhì)或TC（親水處理）處理因素外，293T細(xì)胞貼壁性變差極有可能是因?yàn)?strong>空間的隔離導(dǎo)致細(xì)胞自分泌或旁分泌產(chǎn)生的信號(hào)分子濃度太低，不利于細(xì)胞的貼壁或增殖。建議在鋪板前，對(duì)孔板進(jìn)行明膠（abs9357）包被，可有效促進(jìn)細(xì)胞貼壁。
 

四、最后咱們要討論的是轉(zhuǎn)染病毒后細(xì)胞凋亡嚴(yán)重，如圖5所示，是經(jīng)病毒轉(zhuǎn)染后漂浮凋亡的293T細(xì)胞。
 

圖5 經(jīng)病毒轉(zhuǎn)染后漂浮凋亡的293T細(xì)胞
 

為啥293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染病毒后凋亡嚴(yán)重？在排查了方法步驟和轉(zhuǎn)染試劑，依然沒有改善的情況下，可排查一下轉(zhuǎn)染前的營(yíng)養(yǎng)體系，尤其是血清批間差帶來的影響。很多同學(xué)說前期培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)正常呀，其實(shí)細(xì)胞形態(tài)學(xué)只是鑒別細(xì)胞是否健康的一個(gè)外在指標(biāo)，還要結(jié)合細(xì)胞其它指標(biāo)對(duì)細(xì)胞健康進(jìn)行評(píng)定（比如倍增時(shí)間，存活率）。通過更換血清批次，再進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)并觀察轉(zhuǎn)染后的效果，比較分析出原因。