4D-Labelfree磷酸化揭示毛竹生長(zhǎng)素調(diào)控途徑

4D-Labelfree磷酸化--國(guó)際竹藤研究中心揭示毛竹生長(zhǎng)素調(diào)控途徑

生長(zhǎng)素是植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要調(diào)節(jié)劑，它參與細(xì)胞發(fā)育過程、調(diào)節(jié)植物-環(huán)境相互作用、影響器官發(fā)育。生長(zhǎng)素的轉(zhuǎn)運(yùn)主要由生長(zhǎng)素外排和內(nèi)流載體蛋白控制，在生長(zhǎng)素外排過程中起重要作用的一種二級(jí)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白為，PIN-formed (PIN)蛋白，其極性決定了細(xì)胞間生長(zhǎng)素流動(dòng)的方向性。毛竹作為中國(guó)分布最廣且最具經(jīng)濟(jì)價(jià)值的竹種，目前對(duì)于其體內(nèi)PIN蛋白的認(rèn)知依然較淺、研究也不深入，長(zhǎng)生素運(yùn)輸在毛竹中的作用目前也不清楚。

2023年2月，國(guó)家林業(yè)和草原局北京竹藤科學(xué)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室高健教授研究團(tuán)隊(duì)在International Journal of Biological Macromolecules（IF 8.025）雜志上發(fā)表了題為“Phylogeny, transcriptional profile, and auxin-induced phosphorylation modification characteristics of conserved PIN proteins in Moso bamboo (Phyllostachys edulis)”的研究論文，該研究獲得了毛竹中的PIN基因，并對(duì)起進(jìn)行了理化、結(jié)構(gòu)分析以及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。同時(shí)采用轉(zhuǎn)錄組揭示了PIN1亞家族的調(diào)控作用、采用4D-Labelfree磷酸化修飾組發(fā)現(xiàn)了PIN蛋白和蛋白激酶的磷酸化過程響應(yīng)生長(zhǎng)素的調(diào)節(jié)，并構(gòu)建了一個(gè)以PIN蛋白為核心的植物激素相互作用網(wǎng)絡(luò)。中科新生命為該研究提供了4D-Labelfree磷酸化修飾組技術(shù)服務(wù)。

 

 

研究材料

不同生長(zhǎng)時(shí)期、不同處理方式的的毛竹竹筍，毛竹不同部位的組織（葉片、花芽、根莖尖等）

 

 技術(shù)路線

步驟1：毛竹PIN基因家族的鑒定、理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)分析；

步驟2：PIN基因家族的染色體分布、共向進(jìn)化關(guān)系和系統(tǒng)發(fā)育樹分析；

步驟3：轉(zhuǎn)錄組學(xué)和qRT-PCR方法分析PIN基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)模式；

步驟4：生長(zhǎng)素誘導(dǎo)的毛竹中PIN蛋白磷酸化修飾組分析；

步驟5：以PIN蛋白為中心的植物激素整合調(diào)控模型分析。

 

 研究?jī)?nèi)容

1. 毛竹PIN基因家族的鑒定、理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)分析

為了鑒定毛竹中的候選PIN基因，將擬南芥和水稻的PIN蛋白序列與毛竹基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，共得到23條PIN基因序列。對(duì)這些PIN基因家族的啟動(dòng)子區(qū)域、順式作用元件和基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析后，發(fā)現(xiàn)PIN家族均含有植物激素相關(guān)響應(yīng)元件、光響應(yīng)和myb結(jié)合元件，表明竹子的生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)和光信號(hào)通路密切相關(guān)，并受到MYB轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。但是不同PIN亞家族間（PIN1、PIN2和PIN9亞家族與PIN5、PIN8亞家族）motif、結(jié)構(gòu)域和外顯子數(shù)量上不一致，這也導(dǎo)致了毛竹PIN基因的功能特異性（圖1）。另外，由于PIN蛋白作為跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的特異性，其空間結(jié)構(gòu)至關(guān)重要，作者分析了PIN蛋白家族的三維結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)毛竹中很多PIN蛋白均可以特異性結(jié)合生長(zhǎng)素，揭示不同的PIN蛋白在不同時(shí)間或在不同器官負(fù)責(zé)生長(zhǎng)素的運(yùn)輸（圖2）。
 

 

圖2 PIN蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

 

2. PIN基因家族的染色體分布、共向進(jìn)化關(guān)系和系統(tǒng)發(fā)育樹分析

進(jìn)化過程中基因家族的擴(kuò)張和收縮會(huì)影響基因結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響基因功能的分化，作者分析了毛竹PIN基因（PhePIN）家族的基因組同線群和比較共聯(lián)圖。研究發(fā)現(xiàn)分布在不同的染色體上的PIN基因的復(fù)制并導(dǎo)致毛竹中PIN家族基因的數(shù)量遠(yuǎn)高于水稻和擬南芥。全基因組水平上構(gòu)建的水稻、玉米和馬竹的比較共聯(lián)圖譜，發(fā)現(xiàn)毛竹的17個(gè)PhePIN基因與這3個(gè)物種的基因具有共線關(guān)系，表明這些基因在進(jìn)化早期就出現(xiàn)并穩(wěn)定存在。毛竹PIN基因在進(jìn)化上較為保守(圖3)。
 

為了研究毛竹PIN基因家族的系統(tǒng)發(fā)育模式，作者選取了水稻、玉米、擬南芥等物種中的PIN基因、不同竹科的PIN基因分別與毛竹進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。結(jié)果顯示PhePIN基因相對(duì)保守，在竹亞科內(nèi)親緣關(guān)系較近（圖4A）。另外，在竹科中，由于染色體倍性變化不大，其生物學(xué)功能可能更為集中和相似（圖4B）。
 

圖4 毛竹PIN基因的系統(tǒng)發(fā)育樹

 

3. 轉(zhuǎn)錄組學(xué)和qRT-PCR方法分析PIN基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)模式

為了研究PIN基因家族的生物學(xué)功能，作者采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法對(duì)不同毛竹組織（圖5A）、不同生長(zhǎng)發(fā)育階段的竹筍（圖5B）、不同處理方式的竹筍（圖5C）中的PIN基因的表達(dá)模式分別進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PhePIN1亞家族和PhePIN9-5基因在所有數(shù)據(jù)中均特異性的高表達(dá)，其他基因在不同發(fā)育階段、不同組織、不同處理中均有不同程度的特異性表達(dá)。

為了確定PIN基因的表達(dá)模式，作者采用3個(gè)月大的幼苗的根、莖和葉進(jìn)行了qRT-PCR (圖6)。研究發(fā)現(xiàn)PIN1亞家族決定了不同PIN亞家族的主要調(diào)控作用，該發(fā)現(xiàn)證實(shí)了生長(zhǎng)素合成與作用位點(diǎn)的不一致可能是由于PIN蛋白的極性轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控。此外，對(duì)不同生長(zhǎng)發(fā)育階段的竹筍的上部、中部和基部進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)PIN基因在不同發(fā)育階段處于不同的作用位置，表明生長(zhǎng)素在快速生長(zhǎng)期的作用位置與快速生長(zhǎng)期之前的位置不一樣。

 

圖6 qRT-PCR驗(yàn)證PIN基因表達(dá)模式

 

4. 生長(zhǎng)素誘導(dǎo)的毛竹中PIN蛋白磷酸化修飾組分析

PIN蛋白介導(dǎo)的生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)過程主要通過蛋白磷酸化級(jí)聯(lián)途徑產(chǎn)生。為研究PIN蛋白在生長(zhǎng)素調(diào)控竹子快速生長(zhǎng)過程中的作用，作者采用4D-Labelfree磷酸化修飾組對(duì)生長(zhǎng)素處理的毛竹快速生長(zhǎng)期(筍高4m)第18節(jié)間進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)磷酸化修飾主要發(fā)生在PIN1亞家族中的PhePIN2-1和PhePIN9-5蛋白上，多個(gè)磷酸化激酶也發(fā)生了磷酸化修飾。磷酸化修飾肽的保守motif基序分析發(fā)現(xiàn)在毛竹中主要的基序是[S_PxxxxK]、[xKxxxS_Pxxxx]、[xxxxxS_PxxxxxG]、[xxxxxx_S_PRxxxx]、[xxxxxs_pxxxxx]和[xxxxx_S_Pxxxxx]，與報(bào)道的motif不同。綜上所述，PIN蛋白及其相關(guān)蛋白的磷酸化修飾是生長(zhǎng)素誘導(dǎo)修飾的重要組成部分，PIN1蛋白亞家族在PIN蛋白中起主要的磷酸化作用。竹子的特異性決定了其保守磷酸化motif基序的差異。

 

圖7 生長(zhǎng)素誘導(dǎo)的毛竹中PIN蛋白磷酸化修飾組分析

 

5. 以PIN蛋白為中心的植物激素整合調(diào)控模型分析

為了研究PIN蛋白介導(dǎo)的激素間調(diào)節(jié)模式，作者通過同源比對(duì)鑒定了毛竹中所有已報(bào)道的植物激素家族成員及其相關(guān)蛋白激酶，然后利用獲得的蛋白質(zhì)序列和STRING數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)蛋白間互作關(guān)系以及篩選與毛竹PIN蛋白的互作蛋白（圖8）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)互作蛋白網(wǎng)絡(luò)中涉及7個(gè)PIN蛋白，且PIN蛋白的調(diào)控蛋白主要集中在生長(zhǎng)素信號(hào)通路中。乙烯、脫落酸和赤霉素信號(hào)通路參與了PIN蛋白的調(diào)控。4種蛋白激酶參與PIN蛋白的相互調(diào)控。

 

圖8 毛竹中PIN蛋白相互作用蛋白預(yù)測(cè)

 

小結(jié)

生長(zhǎng)素的極性轉(zhuǎn)運(yùn)是生長(zhǎng)素發(fā)揮其功能的重要途徑，生長(zhǎng)素在毛竹的快速生長(zhǎng)中起著不可替代的作用。作者對(duì)毛竹中PIN-FORMED生長(zhǎng)素外流載體進(jìn)行了鑒定和結(jié)構(gòu)分析，從5個(gè)基因亞家族中獲得了23個(gè)PhePIN基因。對(duì)216個(gè)PIN基因的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，PIN基因在竹科進(jìn)化中相對(duì)保守，在毛竹中經(jīng)歷了科內(nèi)段復(fù)制。PIN基因的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析表明，PIN1亞家族起著主要的調(diào)控作用。PIN基因與生長(zhǎng)素生物合成在時(shí)空分布上保持高度一致。磷酸化蛋白組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)許多磷酸化蛋白激酶通過自磷酸化和PIN蛋白磷酸化響應(yīng)生長(zhǎng)素調(diào)節(jié)。蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)顯示存在一個(gè)以PIN蛋白為核心的植物激素相互作用調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。該研究提供了一個(gè)全面的PIN蛋白分析，補(bǔ)充了毛竹的生長(zhǎng)素調(diào)控途徑，為進(jìn)一步研究竹子的生長(zhǎng)素調(diào)控鋪平了道路。

 

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