基因編輯技術(shù)：小分子抑制劑控制 Cas9 活性

基因編輯是一種對(duì)靶基因或轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行敲除、插入和定點(diǎn)突變等精確修飾的基因工程技術(shù)，主要通過人工核酸酶實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組的特定基因序列的敲除、插入或精確修飾。目前，主要有三大基因編輯技術(shù)，包括：鋅指核酸酶 (Zinc finger nucleases; ZFNs) 技術(shù)，轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶 (transcription activator-like (TAL) effector nucleases; TALENs) 技術(shù)和 CRISPR/Cas9 技術(shù)。 ZFNs 是最較早用于基因組編輯的人工合成的限制性內(nèi)切酶，該酶是異源二聚體，包含 DNA 結(jié)合鋅指蛋白 (ZFP) 結(jié)構(gòu)域和非特異性 FokI 核酸酶結(jié)構(gòu)域。DNA 切割域的 FokI 核酸酶必須二聚化以切割 DNA。該技術(shù)已被用于修飾各種生物體內(nèi)的內(nèi)源性基因。 與 ZFNs 的模塊化結(jié)構(gòu)一樣，TALENs 的羧基末端也含有 FokI 核酸酶結(jié)構(gòu)域，它借助 TALEs (來源于植物致病性黃單胞菌屬細(xì)菌) 來識(shí)別特異性 DNA 堿基對(duì)。相較于 ZFNs 技術(shù)，其優(yōu)勢(shì)在于可以定點(diǎn)識(shí)別靶基因，從而使得基因編輯更加準(zhǔn)確高效，其脫靶效應(yīng)以及細(xì)胞毒性也得到了顯著改善。 

圖 1. 不同基因編輯手段的對(duì)比

 

2020 年，兩位女性科學(xué)家 Emmanuelle Charpentier 和 Jennifer A. Doudna 因發(fā)現(xiàn) CRISPR/Cas9 基因剪刀，而獲得 2020 年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。

 

CRISPR/Cas 系統(tǒng)由一小段 RNA 和一種高效的 DNA 切割酶 (Cas 核酸酶) 組成的系統(tǒng)，該技術(shù)不像 TALENs 技術(shù)和 ZFNs 技術(shù)是依賴于蛋白與靶基因之間的識(shí)別，而是由 sgRNA 和靶基因之間形成復(fù)合物，從而完成特定基因序列的編輯。

 

CRISPR/Cas9 技術(shù)切割效率相對(duì)較高且操作簡(jiǎn)單，并且可以同時(shí)進(jìn)行多位點(diǎn)的編輯�？傊�，三種不同的基因編輯技術(shù)都有其各自的特點(diǎn)。今天小 M 的“重頭戲”，CRISPR/Cas9。 

 

CRISPR/Cas9 的調(diào)控機(jī)制 在細(xì)菌及古細(xì)菌中，CRISPR 系統(tǒng)共分成 3 類，其中 I 類和 Ⅲ 類需要多種 CRISPR 相關(guān)蛋白 (Cas 蛋白) 共同發(fā)揮作用。而來自 Streptococcus pyogenes 的 Ⅱ 型系統(tǒng)只需要一種 Cas 蛋白 (Cas9) 即可發(fā)揮核酸內(nèi)切酶活性。因此，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)應(yīng)用最為廣泛。CRISPR/Cas9 系統(tǒng)已經(jīng)成功應(yīng)用于植物、細(xì)菌、酵母、魚類及哺乳動(dòng)物細(xì)胞。  

 

■ 第一步：捕獲外源 DNA

Cas9 蛋白包含兩個(gè)核酸酶結(jié)構(gòu)域：切割非互補(bǔ) DNA 鏈的 RuvC 結(jié)構(gòu)域和切割互補(bǔ) DNA 鏈的 HNH 結(jié)構(gòu)域 (如圖 2a)。

噬菌體等外源 DNA 入侵時(shí)，CAS 蛋白復(fù)合物通常識(shí)別 3' 端含 NGG 的前間隔序列鄰近基序 (PAM) 區(qū)域。然后，侵入的噬菌體或質(zhì)粒釋放的短 DNA 片段(稱為 Protospacer)，插入宿主 CRISPR 位點(diǎn)中 (由重復(fù)序列隔開)。

 

■ 第二步：crRNA 合成 

CRISPR 序列轉(zhuǎn)錄，形成前體 CRISPR RNA (pre-crRNA)。Cas9 及 RNase III 在 tracrRNA 與 pre-crRNA 上的重復(fù)序列配對(duì)形成雙鏈 RNA 的條件下，對(duì) pre-crRNA 進(jìn)行剪切，形成成熟的 tracrRNA-crRNA 雙鏈 RNA (即 sgRNA)。Cas9 核酸酶和 sgRNA 形成 Cas9 核糖核蛋白 (RNP)。

 

■ 第三步：靶向干擾

當(dāng)外源 DNA 再次進(jìn)入細(xì)胞時(shí)，Cas9 蛋白攜帶sgRNA，去識(shí)別外源 DNA 的 Protospacer (前間隔序列)，并與之結(jié)合，通過 Cas9 解旋酶和核酸酶對(duì)靶基因進(jìn)行剪切。造成靶基因 DNA 的雙鏈斷裂 (DSB)，從而達(dá)到干擾靶基因表達(dá)的目的，在修復(fù)斷裂同時(shí)引入基因敲除或敲入。

圖 2. 通過非同源末端連接 (NHEJ) 或同源定向修復(fù) (HDR) 內(nèi)源性修復(fù)雙鏈 DNA 斷裂^[2]

 綜上，CRISPR 技術(shù)主要是利用位點(diǎn)特異 Cas 核酸酶在基因組靶位點(diǎn)處引入 DNA DSB，再經(jīng)細(xì)胞自身的非同源末端連接 (NHEJ) 或同源重組修復(fù) (HDR) 對(duì) DSB 進(jìn)行修復(fù)，最終實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因敲除和堿基編輯等基因組遺傳修飾。  CRISPR/Cas9 的小分子調(diào)控策略 CRISPR 技術(shù)在疾病治療、基因功能調(diào)控、藥物研發(fā)等多個(gè)方面具有廣闊的應(yīng)用前景，但也存在脫靶、基因毒性等副作用問題。由于 Cas9 蛋白和 sgRNA 在其自身活性、識(shí)別位點(diǎn)及結(jié)合能力等方面的不同特性，因此在應(yīng)用中可以通過對(duì) Cas9 蛋白酶以及與靶 DNA的結(jié)合進(jìn)行有效的調(diào)控。目前，如：遺傳調(diào)節(jié)、小分子激活劑、小分子抑制劑、生物響應(yīng)性輸送載體以及 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的光/熱/超聲/磁激活等方法已被研究開發(fā)。 

■ 小分子激活劑控制 Cas9 活性的策略

可通過添加小分子來控制 Cas9 的構(gòu)象變化，來實(shí)現(xiàn)對(duì) Cas9 蛋白活性的時(shí)空控制。

 

案例 1：當(dāng)內(nèi)含肽插入 Cas9 蛋白的不同位點(diǎn)，Cas9 核酸酶失活；添加 4-HT (4-hydroxytamoxifen)，通過構(gòu)象變化和自切割反應(yīng)去除內(nèi)含肽，可重新激活 Cas9 蛋白（圖 3a）。根據(jù)內(nèi)含肽的插入位點(diǎn)，Cas9 的激活效率 3 倍到 10 倍不等，與野生型 Cas9 相比，這種調(diào)控策略可增加開/脫靶效應(yīng)比率。

 

圖 3. 小分子激活劑控制 Cas9 活性的策略^[9]

a：通過 4-HT 結(jié)合，恢復(fù)失活的 Cas9 活性；b：Cas9 和雌激素受體 (ERT2) 的融合被分離在細(xì)胞質(zhì)中，通過添加 4-HT 使得融合物進(jìn)入細(xì)胞核，形成 Cas9/sgRNA 復(fù)合物  

案例 2：基于化學(xué)誘導(dǎo)的 Cas9 蛋白分裂片段的二聚化。Zetsche 等人設(shè)計(jì)了不同的分裂位點(diǎn) (Arg535 和 Glu573) 生成分裂 Cas9 (split-Cas9) 蛋白，同時(shí)產(chǎn)生 C 端和 N 端Cas9 片段 (可分別與 FK506  結(jié)合蛋白 (FKBP) 和 FKBP 雷帕霉素結(jié)合結(jié)構(gòu)域 (FRB) 結(jié)合)。這種方法通過雷帕霉素誘導(dǎo)的異源二聚作用實(shí)現(xiàn)了 split-Cas9 的條件重構(gòu)和激活。

 

 

■ 小分子抑制劑控制 Cas9 活性的策略

由于 Cas9 活性的升高和持續(xù)可能會(huì)導(dǎo)致脫靶效應(yīng)、染色體易位和遺傳毒性，因此在目標(biāo)編輯后，Cas9 核酸酶活性必須迅速限制在一個(gè)狹窄的時(shí)間范圍內(nèi)。

 

如下圖 5 所示，DHFR (ER50)是一個(gè)不穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)域，可快速靶向 Cas9 蛋白進(jìn)行蛋白酶體介導(dǎo)的 Cas9 降解，但添加小分子抑制劑甲氧芐氨嘧啶 (TMP) 或 4-OHT 后可以使其穩(wěn)定。用 Cas9-DHFR 或 Cas9-ER50 系統(tǒng)編輯 VEGFA 基因時(shí)，用不同劑量的TMP 或 4OHT 劑量依賴性控制靶向 VEGFA 基因的復(fù)合物 Cas9-DHFR (ERR50) 的靶向和非靶向活性。 

 

總結(jié)
CRISPR-Cas9 系統(tǒng)已成為一種在任何細(xì)胞基因組的精確位置進(jìn)行修改的有效工具。Cas9 介導(dǎo)的 DNA 切割后發(fā)生的主要細(xì)胞修復(fù)途徑是錯(cuò)誤的非同源末端連接 (NHEJ) 途徑。同源定向重組 (HDR) 的效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于 NHEJ。因此，降低 NHEJ 的頻率，同時(shí)增加 Cas9 介導(dǎo)的 DNA 切割后的 HDR 效率，從而提高基因組編輯的整體效率和精準(zhǔn)度成為科學(xué)家關(guān)注的焦點(diǎn)。與此同時(shí)，通過研究人員的不斷努力，生物活性小分子提供了一種簡(jiǎn)單而有效的調(diào)控策略，可進(jìn)一步拓寬精確基因組編輯的應(yīng)用范圍。 

相關(guān)產(chǎn)品

RS-1  一種 RAD51 的激活劑，同時(shí)可增強(qiáng) CRISPR/Cas9 的活性。

Nocodazole 可逆的 microtubule 抑制劑。Nocodazole 抑制 Bcr-Abl，增強(qiáng) CRISPR/Cas9 的活性。

Brefeldin A  一種內(nèi)酯抗生素，是蛋白質(zhì)運(yùn)輸?shù)奶囟ㄒ种苿�。Brefeldin A 還是一種 CRISPR/Cas9 激動(dòng)劑，可抑制 HSV-1病毒，并具有抗癌活性。

SCR7 pyrazine 一種 DNA 連接酶 IV (DNA ligase IV) 抑制劑。SCR7 pyrazine 也是一種 CRISPR/Cas9 的增強(qiáng)子，可提高 Cas9 介導(dǎo)的同源性定向修復(fù) (HDR) 的效率。

SCR7 一種不穩(wěn)定的形式，可以自動(dòng)循環(huán)成穩(wěn)定形式的 SCR7 pyrazine是一種 CRISPR/Cas9 的增強(qiáng)子，可提高 Cas9 介導(dǎo)的同源性定向修復(fù) (HDR) 的效率

Zidovudine 一種核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑 (NRTI)，有潛力用于 HIV 感染的研究。Zidovudine 增強(qiáng) CRISPR/Cas9調(diào)節(jié)的編輯頻率。

MCE 的所有產(chǎn)品僅用作科學(xué)研究或藥證申報(bào)，我們不為任何個(gè)人用途提供產(chǎn)品和服務(wù)。

 

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