CytoSense 在微生物檢測(cè)中的應(yīng)用

1、前言

每種微生物基本都有各自的特異性表面抗原，使用單抗偶聯(lián)各種熒光素可方便檢測(cè)各種樣品中的微生物。樣品經(jīng)熒光染色（如SYBR Green I 或其他染色劑染色）后，可用CytosSense 測(cè)定微生物含量。(高通量：>200000cell ; 粒徑：0.1-700μm) ，目前可直接檢測(cè)大腸桿菌，嗜血桿菌、沙門氏菌、結(jié)核桿菌、銅綠假單胞菌、軍團(tuán)桿菌等。在瑞士，F(xiàn)CM方法被列為標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌監(jiān)測(cè)方法。

常用核酸染料：
SYBR Green I ——滲透膜，檢測(cè)活細(xì)胞。
PI (碘化丙定) ——不滲透膜，只能通過破損的細(xì)胞膜，檢測(cè)死細(xì)胞。
當(dāng)然，也可以根據(jù)檢測(cè)目的選擇其他激光波長和熒光帶與目標(biāo)染料進(jìn)行最佳匹配染色。

488nm激光器可激發(fā)多種熒光素
 
2、CytoSense 檢測(cè)微生物所需配置

2.1 激光檢測(cè)器配置：488nm激光器，綠/黃檢測(cè)熒光通道。

2.2 進(jìn)樣系統(tǒng)設(shè)置：使用CytoSense 檢測(cè)細(xì)菌時(shí)我們建議在樣品泵中使用特殊的管道，以盡量減少染色細(xì)胞粘附在管道上，對(duì)其他操作沒有影響。即更換下圖配件：
 

2.3 鞘液設(shè)置：

A） 實(shí)驗(yàn)室手動(dòng)染色樣品

如果樣品制備中進(jìn)行了細(xì)胞清洗，則直接上機(jī)檢測(cè)沒有影響；如果樣品沒有清洗，樣品含有游離染料，則有兩種選擇：

a）“正常使用循環(huán)鞘液”：為防止染料在鞘液中積聚，緩慢增加熒光通道中的背景信號(hào)，因此建議定期投加氯�？梢酝ㄟ^安裝加氯泵實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，或者，我們可以安裝一個(gè)帶有流動(dòng)開關(guān)的特殊過濾器（下圖），以從鞘液中去除染料。

b） 使用“非循環(huán)鞘液系統(tǒng)”：可將“受污染”的鞘液會(huì)立即從儀器中排出，無需再循環(huán)，本方案只需為鞘液提供足夠的清潔水。外置鞘液系統(tǒng)有利于保護(hù)管路和內(nèi)置的過濾系統(tǒng)，延長其使用壽命。濁度較高的樣品，藻濃度較高的樣品，也可以使用外置鞘液系統(tǒng)來運(yùn)行儀器。

 

外置鞘液系統(tǒng)連接方式如下：（標(biāo)準(zhǔn)CytoSense即可，用戶可方便自行改裝）
 

非循環(huán)外置鞘液系統(tǒng)

 

B） 現(xiàn)場(chǎng)自動(dòng)染色監(jiān)測(cè)

增加配件 “細(xì)菌染色模塊”，可以自動(dòng)調(diào)節(jié)鞘液。同時(shí) “染色模塊”，可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)染色。適用于水中微生物我的在線自動(dòng)監(jiān)測(cè)。

 

使用方法：與正常細(xì)胞檢測(cè)一樣，沖洗、啟動(dòng)和分析操作是自動(dòng)化的，所有程序都在軟件中編寫。熒光染料有時(shí)需要在瓶子空了之后重新填充，定期更換氯和過濾器-取決于使用情況等，可自動(dòng)運(yùn)行幾個(gè)月。
 

※ 對(duì)于已經(jīng)擁有CytoSense的最終用戶，不需要購買另一臺(tái)CytoSense，只需加配染色模塊，對(duì)現(xiàn)有CytoSense做微小調(diào)整，以適應(yīng)與染色模塊的耦合（如電子連接和安裝不同類型的樣品泵）。

3、應(yīng)用案例

3.1 上升流系統(tǒng)和人為活動(dòng)對(duì)巴西沿海地區(qū)微生物多樣性的影響(巴西里約熱內(nèi)盧聯(lián)邦大學(xué))
 

細(xì)菌活性測(cè)定   利用CytoSense 測(cè)定細(xì)菌濃度，配置488nm，20mV固體藍(lán)色激光，側(cè)向散射（SWS，446/500nm）檢測(cè)器和紅色（葉綠素-a）熒光（FL1-669/725nm）；橙色/黃色（FL-2，601/651nm），綠色/黃色（FL-3，515/585nm）熒光檢測(cè)器。使0.92和10mm的黃綠色熒光小球作為內(nèi)標(biāo)，并使用Length，SWS和Average，OFL參數(shù)進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定。細(xì)菌樣本使用SYBER Green I 染色，通過側(cè)向散射SWS和橙色熒光信號(hào)進(jìn)行鑒別。

3.2 CytoSense分析大容量沖擊采樣器采集的空氣中細(xì)菌(丹麥奧胡斯大學(xué))
 

空氣中細(xì)菌細(xì)胞的特性需要有效的收集、濃縮和分析技術(shù)，特別是要克服它們?cè)谑彝猸h(huán)境中被稀釋的挑戰(zhàn)。建立了一種快速、可靠的空氣中細(xì)菌定量方法。為此，采用大容積沖擊取樣器從污水處理廠（WWTP）收集空氣中的細(xì)菌。用CytoSense測(cè)定細(xì)菌細(xì)胞密度，并與基于16srRNA基因的定量PCR（qPCR）數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。結(jié)果表明，該方法對(duì)室外環(huán)境中細(xì)菌密度的估計(jì)是可靠的，用CytoSense法進(jìn)行分析比qPCR法更快、更靈敏。此外，不同的取樣條件下，CytoSense可提供有價(jià)值的細(xì)胞特征信息。
 

采用CytoSense對(duì)沖擊式氣體采樣器收集到的氣載細(xì)菌和參考菌株大腸桿菌進(jìn)行計(jì)數(shù)和鑒定。配置488nm激光器，550nm的高靈敏度黃光發(fā)射傳感器。同時(shí)記錄每個(gè)粒子的脈沖形狀的信號(hào)可用于估計(jì)細(xì)胞體積，并將細(xì)胞定義為不同細(xì)胞類型的特定簇。分析粒子體積通過FWS的掃描脈沖圖或SWS的掃描脈沖圖估算。

 

3.3 絲狀菌生物過程中的孢子質(zhì)量在線監(jiān)測(cè)（維也納科技大學(xué)）
 

真菌生物過程中孢子接種物質(zhì)量的測(cè)定尤為重要，因?yàn)槊劝l(fā)孢子的數(shù)量會(huì)影響過程性能，進(jìn)而影響產(chǎn)品效價(jià)。因此，需要確定孢子接種體中活孢子的濃度，以便將精確數(shù)量的活孢子接種到生物反應(yīng)器中。根據(jù)孢子接種體的不同，孢子需要不同的時(shí)間段膨脹、萌發(fā)，從而生長菌絲。本文提出的方法不僅可以取代菌落形成單元（CFU）測(cè)定法，而且可以在線監(jiān)測(cè)孢子的溶脹和萌發(fā)。
* 活菌染色熒光素二乙酸酯（FDA）和碘化丙二鈉（PI）能夠區(qū)分代謝活性/活菌/FDA陽性孢子和非活菌孢子
 

3.4 高頻監(jiān)測(cè)水生生態(tài)系統(tǒng)中異氧微生物的原位特征及動(dòng)態(tài)（地中海海洋研究所）
 

自動(dòng)染色模塊（SM）安裝于CytoSense，可同時(shí)原位自動(dòng)采樣、分析浮游植物和細(xì)菌。水樣在行船過程中持續(xù)泵入系統(tǒng)，SYBR Green I熒光染料通過小的染色容器逐滴加入樣品（V/V=1：10000），經(jīng)15min 染色反應(yīng)后自動(dòng)泵入CytoSense。通過本次項(xiàng)目地中海海洋研究所展示了CytoSense 不僅可以檢測(cè)自發(fā)熒光的浮游植物，而且可檢測(cè)細(xì)菌、鞭毛蟲、纖毛蟲等微生物。經(jīng)過2 小時(shí)一次共七天的實(shí)驗(yàn)，獲得了更多有效數(shù)據(jù)。

4、參考文獻(xiàn)

[1] Cury JC, Araujo FV, Coelho-Souza SA, et al. Microbial diversity of a Brazilian coastal region influenced by an upwelling system and anthropogenic activity. PLoS One, 2011, 6(1): e16553.

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[3 L. Haraguchi, H. H. Jakobsen, N. Lundholm, J. Carstensen. Monitoring natural phytoplankton communities: a comparison between traditional methods and pulse-shape recording flow cytometry. Aquat. Microb. Ecol., 2017, 80: 77-92.

[4] J. Jang, N. B. Hendriksen, H. H. Jakobsen, U. Gosewinkel. Application of Cytosense flow cytometer for the analysis of airborne bacteria collected by a high volume impingement sample. Journal of Microbiological Methods, 2018, 154 : 63–72.

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[6] Ehgartner, D., Herwig, C., & Neutsch, L. At-line determination of spore inoculum quality in Penicillium chrysogenum bioprocesse. Applied Microbiology and Biotechnology, 2016, 1-11.

[7] Ehgartner, D., Fricke, J., Schröder, A., & Herwig, C. (2016). At-line determination of spore germination of Penicilliumchrysogenumbioprocesses in complex media. Fungal Genetics and Biology, Manuskript in preparation.

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