應(yīng)用自動在線流式細胞術(shù)實時監(jiān)測海洋海岸微生物濃度

摘要
海洋微生物無處不在，通過光合作用和生物地球化學(xué)循環(huán)等關(guān)鍵過程，在海洋中發(fā)揮著基本作用。由于其很高的更替頻率和不完整的分布，監(jiān)測時需要在正確的時間和空間取樣。使用兩個在線流式細胞儀系統(tǒng)對那不勒斯灣沿岸地區(qū)的海洋微生物進行了監(jiān)測，驗證一種新的概念，證明該技術(shù)可以作為一個實時水質(zhì)報警系統(tǒng)的有用工具。建議將細菌和微型浮游植物濃度作為水質(zhì)的一般指標，這是評估環(huán)境條件變化的影響所必需的第一步，隨后將深入分析群落組成是否存在病原體或其他指標。在調(diào)查期間，我們發(fā)現(xiàn)在未經(jīng)處理的城市廢物排放區(qū)或河流輸入?yún)^(qū)細菌濃度高。一般說來，細菌的豐度與鹽度呈負相關(guān)，這表明它們利用陸地來源的有機物進行生長。所使用的技術(shù)方法也是根據(jù)旨在評估和改善歐洲海洋水域質(zhì)量的歐洲指令2008/56/EC，是監(jiān)測沿海地區(qū)的一種有用和快速的方法。

介紹
海洋微生物具有高度的動態(tài)性，對生態(tài)系統(tǒng)性質(zhì)的變化反應(yīng)非�？�，從而導(dǎo)致急性污染事件為了捕捉這些反應(yīng)并確定其原因，需要高頻準確的測量。大多數(shù)用于監(jiān)測海洋微生物的方法都存在重復(fù)性低、響應(yīng)時間長和對勞動力要求高的問題。流式細胞術(shù)提供了一個解決這些限制的方法，允許快速、準確和可復(fù)制的海洋微生物計數(shù)，并在海洋生態(tài)學(xué)研究中得到了廣泛的應(yīng)用。流式細胞術(shù)是一種利用散射和熒光來鑒別和計數(shù)細胞類型的非軸測、基于單細胞的方法。由于光合色素的自熒光性，光合微生物可以直接分析，而非自熒光微生物（如異養(yǎng)細菌）則需要在分析前進行染色。染色步驟需要樣品處理和孵育時間，這是正確評估細胞濃度所必需的。在環(huán)境科學(xué)中，自動流式細胞術(shù)已用于自發(fā)熒光微生物和染色后的異養(yǎng)細菌。我們將這兩種方法結(jié)合起來，分別使用了用于在線分析光營養(yǎng)微生物的Cytosense（CytoBuoy BV）和連接到海洋航行船的泵的OnCyt自動流式細胞儀（OnCyt Microbiology AG）。證明了高空間分辨率監(jiān)測表面微生物分布是可行的，并提供了有用的第一手信息，可用于快速和實時地指示水質(zhì)。

材料和方法

2017年6月19日在RV Vettoria上采樣。地表水由船泵通過在線熱鹽計 (SBE45 MicroThermalSalinograph，Seabird Electronics)，測量溫度和鹽度，并通過在線熒光計測量總熒光(CycloPS7，Turner Design 連接databank）。然后，水流過采樣裝置，并依次通過Cytosense流式細胞儀（Cytobuy BV）和OnCyt在線流式細胞儀（OnCyt Microbiology AG）。

Cytosense每2分鐘分析一次樣品，而OnCyt每13分鐘（取決于染色時間）分析一次樣品，對應(yīng)每1km 采樣一次，取決于船速。常規(guī)流式細胞儀分析的離散樣本每10分鐘在表面采集一次，以驗證onCyt計數(shù)。在，將這些樣品固定、冷凍并稍后在實驗室用SYBRGreen染色后進行分析。從CytoSense中，獲得了Synechochoccus sp（藍藻）、微微真核生物（1-3μm大小的混合種群）和納米真核生物的計數(shù)（2-10μm大小），同時onCyt提供非熒光，主要是異養(yǎng)細菌的濃度。

結(jié)果與討論

盡管對于自養(yǎng)微微浮游生物（藍藻和微微真核生物），onCyt系統(tǒng)與傳統(tǒng)流式細胞術(shù)的比較已有報道，而且對于異養(yǎng)微生物，onCyt系統(tǒng)已用于淡水系統(tǒng)，但其在海水中的應(yīng)用仍需測試。因此，我們調(diào)整了染色方案，以適應(yīng)onCyt在培養(yǎng)溫度和時間方面的需要。為了保證測量的準確性，在含50 mM EDTA染色之前，樣品中加入多聚甲醛和戊二醛的混合物（1%和0.05%最終濃度）。使用CytoSense和onCyt獲得的細胞計數(shù)與通過常規(guī)流式細胞術(shù)獲得的計數(shù)顯著正相關(guān)，如圖所示，對于細菌，計數(shù)和亞群（高核酸，HNA和低核酸，LNA，圖1c和d）都適用。

 

圖1 通過CytoSense、onCyt和常規(guī)流式細胞術(shù)（Verse）獲得的數(shù)據(jù)驗證。

a）CytoSense Vs Verse藍藻聚球藻計數(shù)的相關(guān)性b）onCyt Vs Verse總異養(yǎng)細菌計數(shù)的相關(guān)性c）通過onCyt獲得的異養(yǎng)細菌的流式圖d）通過Verse獲得的異養(yǎng)細菌生的流式圖

 

上船后，兩臺流式細胞儀在熱鹽分析儀之后連接到船上的采樣線上。然后海水被分成兩條線，一條通向CytoSense，另一條通向onCyt。兩臺儀器同時采集了樣本。
 

圖2 顯示了船的軌跡以及巡航期間收集的溫度、鹽度和熒光值。

兩個低鹽度區(qū)域很明顯，一個靠近港口（Torre Annunziata），另一個位于受薩諾河（Sarno）影響的區(qū)域。第一個位于離海岸一英里的城市垃圾收集站附近。第二條河流與薩諾河相對應(yīng)，薩諾河流經(jīng)幾個農(nóng)村和城市地區(qū)，然后排入那不勒斯灣。a）溫度，b）葉綠素?zé)晒�，c）航跡，d）鹽度。箭頭表示鹽度較低的地點，Torre Annunziata（上圖）和Sarno（下圖）

 

細菌總濃度顯示出這兩個區(qū)域?qū)��?yīng)的峰值，第一個區(qū)域（Torre Annunciata）的最高濃度為1.5 x 106cell/ml，第二個區(qū)域（Sarno）的濃度為1.4 x 106cell/ml（圖3）。盡管HNA在Torre Annunziata占主導(dǎo)地位，但HNA和LNA均存在于Sarno現(xiàn)場（未顯示），表明采樣軌跡沿線的群落組成發(fā)生了變化。事實上，HNA和LNA現(xiàn)在被識別為不同的細菌集群，最終代表了相同的較大分支，但屬于不同的分類單元，而不像以前認為的那樣，是更多（HNA）或更少（LNA）活性細菌。

 

圖3 樣本軌跡（左側(cè)）和中異養(yǎng)細菌總濃度（右側(cè)）cell/ ml

在Sarno現(xiàn)場采集的樣本顯示存在大腸桿菌，這是近期糞便污染的指標，但在Torre Annunziata現(xiàn)場（Milva Pepi，pers.Comm.）沒有，這表明在僅根據(jù)細菌總濃度正確評估人類健康風(fēng)險之前，進一步進行細菌分析的重要性。有毒藻類也是如此，其中單獨的分類鑒定并不總是與必須使用其他適當(dāng)?shù)臋z測方法證明的毒素的存在相對應(yīng)。

 

自養(yǎng)微生物組分也顯示出兩個區(qū)域之間的明顯分離，藍細菌聚球藻（Synechococcus）在南部地區(qū)占優(yōu)勢，而微微真核生物和隱藻在北部地區(qū)占優(yōu)勢（圖4）。這也證實了先前的觀察結(jié)果，表明原核生物（藍藻）與大型真核生物（微微真核生物和隱藻）對不同的環(huán)境線索做出反應(yīng)，后者通常負責(zé)總?cè)~綠素的峰值（如熒光模式所示，圖1b）。

 

結(jié)論

自動高頻流式細胞儀被證明是一種檢測海洋微生物的成本效益高、速度快的方法，允許實時測量細胞濃度與環(huán)境因素相關(guān)性，以便解釋和潛在地用作水質(zhì)標志，并為進一步干預(yù)鋪平道路。反過來，微生物群落，特別是異養(yǎng)細菌，似乎是環(huán)境條件變化的有用標志，需要考慮并納入水質(zhì)評估，如歐洲指令2008/56/EC所要求的，其目標是在2020年內(nèi)達到所有歐洲水域的良好環(huán)境狀態(tài)（GES）。

由于細菌細胞總數(shù)可能不會進一步反映致病性或毒性對人類健康的風(fēng)險，因此必須謹慎行事。然而，流式細胞術(shù)可能是首次篩選的一種有價值的方法，實時預(yù)警潛在的關(guān)鍵位點，以便通過其他方法進一步監(jiān)測和控制。
 

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