P4SPR分子互作平臺(tái)在開(kāi)發(fā)抗天冬酰胺酶抗體檢測(cè)方法中的應(yīng)用

接受天冬酰胺酶治療的急性淋巴細(xì)胞白血病患者的反應(yīng)監(jiān)測(cè)：等離子體傳感檢測(cè)在臨床樣品分析中的成功與挑戰(zhàn)

急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)是一種源于骨髓的未成熟白細(xì)胞發(fā)生癌變的疾病，除了阻止其他血細(xì)胞的正常功能外，還會(huì)在血流中引起增殖并隨后擴(kuò)散到器官。大腸桿菌L -天冬酰胺酶(EcAII)作為一種生物治療劑，被證明對(duì)ALL有效的主要治療藥物之一。接受這種治療的挑戰(zhàn)，患者可能會(huì)通過(guò)產(chǎn)生抗體來(lái)中和EcAII，導(dǎo)致生化治療劑沉默失活，從而降低治療效果。
 

圖1  SPR檢測(cè)流程開(kāi)發(fā)示意圖

目前在用L-天冬酰胺酶治療的白血病患者中量化抗天冬酰胺酶抗體的方法是酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）。能否開(kāi)發(fā)一種新的檢測(cè)方法，樣本消耗更少、樣本制備更簡(jiǎn)單、時(shí)效性也更好的方法，以整合到白血病治療與用藥監(jiān)測(cè)中呢？研究者在本文中，利用Affinite Instruments公司的P4SPR分子互作平臺(tái)開(kāi)發(fā)了一種抗天冬酰胺酶抗體檢測(cè)方法。

研究中涵蓋了生物芯片的設(shè)計(jì)、配體的選型、檢測(cè)靈敏度與線性范圍的模型測(cè)試，以及實(shí)際臨床血液樣本的無(wú)稀釋檢測(cè)，與ELISA方法的對(duì)比與優(yōu)化等。

圖2 (A)抗天冬酰胺酶生物芯片 (B)不同的L -天冬酰胺酶受體結(jié)構(gòu) (C) L -天冬酰胺酶抗體直接檢測(cè)與間接檢測(cè)示意

如圖2所示，為了降低血清樣本與芯片的非特異結(jié)合，作者開(kāi)發(fā)了一種表面多肽修飾的傳感芯片；同時(shí)為了考察配體固定時(shí)隨機(jī)固定與定向固定的區(qū)別，除了天然的EcAII，作者還表達(dá)了3種His-tag標(biāo)簽的EcAII：N21-EcAII，N末端20個(gè)氨基酸；N26-EcAII，N末端25個(gè)氨基酸；C8-EcAII，C末端8個(gè)氨基酸。

通過(guò)對(duì)比實(shí)驗(yàn)，相比于其他3種樣本，研究者發(fā)現(xiàn)固定N26-EcAII有顯著的檢測(cè)重復(fù)性。

圖3 N26-EcAII受體檢測(cè)未稀釋人血清中兔抗天冬酰胺酶抗體SPR校正曲線(A)與SPR傳感圖

研究者選用N26-EcAII作為固定配體，通過(guò)在人血清中加入兔抗天冬酰胺酶抗體作為測(cè)試模型，結(jié)合校準(zhǔn)曲線，確定檢測(cè)限為0.5nM; 如圖3所示，當(dāng)分析物濃度在100nM-1uM之間時(shí)，有良好的檢測(cè)動(dòng)態(tài)范圍。

檢測(cè)方法確立后，研究者作了臨床血液樣本的分析測(cè)試。

圖4 直接法SPR與ELISA分析結(jié)果比較

可能是樣品本身的異質(zhì)性(不透明度、色素等)及檢測(cè)方法亟待完善，如圖4所示，初始直接法獲得的SPR結(jié)果與ELISA結(jié)果也有顯著差異；8個(gè)樣本中，只有3個(gè)樣本的SPR結(jié)果與ELISA檢測(cè)有相關(guān)性。

為了克服樣本異質(zhì)性的影響，同時(shí)不影響分析靈敏度和樣品制備環(huán)節(jié)，在此基礎(chǔ)上，使用與ELISA分析相同的二抗，研究者開(kāi)發(fā)了二次檢測(cè)步驟。

圖5 間接法SPR與ELISA分析結(jié)果比較

在改良后的SPR實(shí)驗(yàn)中，如圖5所示，8個(gè)樣本中，7個(gè)樣本檢測(cè)結(jié)果SPR法與ELISA法一致。研究者推測(cè)，樣本7檢測(cè)結(jié)果不一致，可能與L-天冬酰胺酶固定時(shí)的立體結(jié)構(gòu)方向有關(guān)，與該患者免疫表達(dá)抗體的結(jié)合位點(diǎn)沒(méi)有有效暴露而導(dǎo)致。

在本文中，研究者通過(guò)多角度的摸索優(yōu)化，在SPR平臺(tái)上，首次實(shí)現(xiàn)了對(duì)臨床血樣中天冬酰胺酶抗體的無(wú)稀釋檢測(cè)。雖然在針對(duì)臨床樣本檢測(cè)中還存在樣本異質(zhì)性、檢測(cè)靈敏度等挑戰(zhàn)，但同時(shí)該文為疾病的預(yù)后監(jiān)測(cè)研究提供了一種新思路。
 

在該文獻(xiàn)中，研究者使用的是Affinite Instruments公司的個(gè)人型分子互作儀P4SPR。P4SPR分子互作儀，四通道設(shè)計(jì)，獨(dú)特的3+1流路模式，一次試驗(yàn)即可獲得三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，參照通道可實(shí)時(shí)扣除背景信號(hào)；與傳統(tǒng)的互作分析方法比較，個(gè)人型分子互作儀P4SPR可提供快速、實(shí)時(shí)、無(wú)標(biāo)記的互作檢測(cè)分析；適合于蛋白、多肽、核酸、多糖、小分子等多種樣品分析；同時(shí)，P4SPR也是一款普通實(shí)驗(yàn)室即可買(mǎi)得起用得起的分子互作檢測(cè)利器。