菌種的保存方法
各種微生物由于遺傳特性不同，因此適合采用的保藏方法也不一樣。一種良好的有效保藏方法，首先應能保持原菌種的優(yōu)良性狀長期不變，同時還須考慮方法的通用性、操作的簡便性和設備的普及性。下面介紹幾種常用的菌種保藏方法：
1.斜面低溫保藏法
將菌種接種在適宜的斜面培養(yǎng)基上，待菌種生長完全后，置于4℃左右的冰箱中保藏，每隔一定時間（保藏期）再轉(zhuǎn)接至新的斜面培養(yǎng)基上，生長后繼續(xù)保藏，如此連續(xù)不斷。此法廣泛適用于細菌、放線菌、酵母菌和霉菌等大多數(shù)微生物菌種的短期保藏及不宜用冷凍干燥保藏的菌種。
放線菌、霉菌和有芽孢的細菌一般可保存6個月左右，無芽孢的細菌可保存1個月左右，酵母菌可保存3個月左右。如以橡皮塞代替棉塞，再用石蠟封口，置于4℃冰箱中保藏，不僅能防止水分揮發(fā)、能隔氧，而且能防止棉塞受潮而污染。這一改進可使菌種的保藏期延長。
此法由于采用低溫保藏，大大減緩了微生物的代謝繁殖速度，降低突變頻率；同時也減少了培養(yǎng)基的水分蒸發(fā)，使其不至于干裂。該法的優(yōu)點是簡便易行，容易推廣，存活率高，故科研和生產(chǎn)上對經(jīng)常使用的菌種大多采用這種保藏方法。其缺點是菌株仍有一定程度的代謝活動能力，保藏期短，傳代次數(shù)多，菌種較容易發(fā)生變異和被污染。
2.石蠟油封藏法
此法是在無菌條件下，將滅過菌并已蒸發(fā)掉水分的液體石蠟倒入培養(yǎng)成熟的菌種斜面（或半固體穿刺培養(yǎng)物）上，石蠟油層高出斜面頂端lcm，使培養(yǎng)物與空氣隔絕，加膠塞并用固體石蠟封口后，垂直放在室溫或4℃冰箱內(nèi)保藏。使用的液體石蠟要求優(yōu)質(zhì)無毒，化學純規(guī)格，其滅菌條件是：150～170℃烘箱內(nèi)滅菌lh；或121℃高壓蒸汽滅菌60～80min，再置于80℃的烘箱內(nèi)烘干除去水分。
由于液體石蠟阻隔了空氣，使菌體處于缺氧狀態(tài)下，而且又防止了水分揮發(fā)，使培養(yǎng)物不會干裂，因而能使保藏期達1～2年，或更長。這種方法操作簡單，它適于保藏霉菌、酵母菌、放線菌、好氧性細菌等，對霉菌和酵母菌的保藏效果較好，可保存幾年，甚至長達10年。但對很多厭氧性細菌的保藏效果較差，尤其不適用于某些能分解烴類的菌種。
有試驗指出，此法用于保藏紅曲霉很合適，保藏1～2年后存活率為100％；也有報道顯示，某些蕈菌菌絲用石蠟油保藏法，在3～6℃保藏時菌絲易于死亡，而在室溫下反而較理想，這是值得注意的。
3.甘油懸液保藏法
此法是將菌種懸浮在甘油蒸餾水中，置于低溫下保藏，本法較簡便，但需置備低溫冰箱。保藏溫度若采用-20℃，保藏期約為0.5～1年，而采用-70℃，保藏期可達10年。
將擬保藏菌種對數(shù)期的培養(yǎng)液直接與經(jīng)121℃蒸汽滅菌20min的甘油混合，并使甘油的終濃度在10％～15％，再分裝于小離心管中，置低溫冰箱中保藏�；蚬こ叹２捎帽痉ū２�。
4.凍干保藏法
冷凍真空干燥保藏法又稱冷凍干燥保藏法，簡稱凍干法。它通常是用保護劑制備擬保藏菌種的細胞懸液或孢子懸液于安瓿管中，再在低溫下快速將含菌樣凍結(jié)，并減壓抽真空，使水升華將樣品脫水干燥，形成完全干燥的固體菌塊。并在真空條件下立即融封，造成無氧真空環(huán)境，最后置于低溫下，使微生物處于休眠狀態(tài)，而得以長期保藏。常用的保護劑有脫脂牛奶、血清、淀粉、葡聚糖等高分子物質(zhì)。
由于此法同時具備低溫、干燥、缺氧的菌種保藏條件，因此保藏期長，一般達5～15年，存活率高，變異率低，是目前被廣泛采用的一種較理想的保藏方法。除不產(chǎn)孢子的絲狀真菌不宜用此法外，其他大多數(shù)微生物如病毒、細菌、放線菌、酵母菌、絲狀真菌等均可采用這種保藏方法。但該法操作比較煩瑣，技術要求較高，且需要凍干機等設備。
5.液氮超低溫保藏法
液氮超低溫保藏法簡稱液氮保藏法或液氮法。它是以甘油、二甲基亞砜等作為保護劑，在液氮超低溫（-196℃）下保藏的方法。其主要原理是菌種細胞從常溫過渡到低溫，并在降到低溫之前，使細胞內(nèi)的自由水通過細胞膜外滲出來，以免膜內(nèi)因自由水凝結(jié)成冰晶而使細胞損傷。美國ATCC菌種保藏中心采用該法時，把菌懸液或帶菌絲的瓊脂塊經(jīng)控制致冷速度，以每分鐘下降1℃/min的速度從0℃直降到-35℃，然后保藏在-150℃～-196℃液氮冷箱中。如果降溫速度過快，由于細胞內(nèi)自由水來不及滲出胞外，形成冰晶就會損傷細胞。據(jù)研究認為降溫的速度控制在（1～10）℃/min，細胞死亡率低；隨著速度加快，死亡率則相應提高。
液氮低溫保藏的保護劑，一般是選擇甘油、二甲基亞砜、糊精、血清蛋白、聚乙烯氮戊環(huán)、吐溫80等，但最常用的是甘油（10%～20%）。不同微生物要選擇不同的保護劑，再通過試驗加以確定保護劑的濃度，原則上是控制在不足以造成微生物致死的濃度。
此法操作簡便、高效、保藏期一般可達到15年以上，是目前被公認的最有效的菌種長期保藏技術之一。除了少數(shù)對低溫損傷敏感的微生物外，該法適用于各種微生物菌種的保藏，甚至連藻類、原生動物、支原體等都能用此法獲得有效的保藏。此法的另一大優(yōu)點是可使用各種培養(yǎng)形式的微生物進行保藏，無論是孢子或菌體、液體培養(yǎng)物或固體培養(yǎng)物均可采用該保藏法。其缺點是需購置超低溫液氮設備，且液氮消耗較多，操作費用較高。
要使用菌種時，從液氮罐中取出安瓿瓶，并迅速放到35～40℃溫水中，使之冰凍熔化，以無菌操作打開安瓿瓶，移接到保藏前使用的同一種培養(yǎng)基斜面上進行培養(yǎng)。從液氮罐中取出安瓿瓶時速度要快，一般不超過1min，以防其他安瓿瓶升溫而影響保藏質(zhì)量。并且取樣時一定要戴專用手套以防止意外爆炸和凍傷。
