細胞衰老改變豬小梁細胞對剪切應力的響應
青光眼通常分為幾種類型，其中原發(fā)性開角型青光眼（POAG）是最常見的一種。盡管對青光眼發(fā)病機制知之甚少，但由于小梁網（TM）處的細胞外基質沉積導致對房水流出的抵抗增加，可能導致眼內壓（IOP）升高，這被認為是POAG的主要危險因素之一。TM位于前房角的角鞏膜緣區(qū)，是一種機械敏感組織，是房水流出眼球外的主要通道。盡管潛在的機制仍然難以捉摸，但據報道，細胞外信號調節(jié)激酶（ERK）通路參與調節(jié)TM中基質金屬蛋白酶（MMPs）的產生。研究表明，ERK通路可以影響人眼小梁細胞（TMCs）中MMPs的分泌，這可能導致ECM的異常積累，從而導致眼壓升高，最終發(fā)展為青光眼。
由IOP驅動的房水的大量流動對常規(guī)的流出通道施加了剪切應力。預計該剪切應力在2-25 dyn/cm2 的范圍內，由于青光眼患者的眼壓升高，該值可能更高�，F有研究表明，TMC可以響應房水流施加的剪切應力，從而提供了一種調節(jié)反饋手段來控制眼壓。
患POAG的風險明顯隨著年齡的增長而增加。TMCs的衰老被認為是POAG發(fā)生或進展的主要危險因素。大量研究表明，細胞衰老可以改變 TMCs 的形態(tài)、細胞骨架、表型和功能的。然而，細胞衰老如何影響TMCs對剪切應力的反應卻鮮為人知。
在這里，生物力學與力生物學教育部重點實驗室、國家納米科學中心、中國科學院力學研究所的一項聯合研究探討了衰老對豬眼小梁（PTM）細胞對剪切應力反應的影響，研究結果表明，細胞衰老損害了PTM細胞對剪切應力的生理反應。
高氧誘導的細胞衰老模型
在這項研究中，研究人員采用了高壓氧治療來誘導衰老細胞。結果發(fā)現，與正常PTM形態(tài) 相比（圖1 A），這些細胞在40% O2中的生長表現出擴大的細胞形態(tài)（圖1 B）。暴露于高氧 2 周后，PTM 細胞的細胞衰老標志物 β-半乳糖苷酶呈陽性（圖1 D），而對照PTM細胞的染色可以忽略不計（圖1 C），如圖1 E所示。此外，流式細胞術結果顯示，與對照組相比（圖1 G），暴露于高氧后，G2/M 期細胞的比例似乎在減少（圖1H）。定量結果顯示在圖1 F。
衰老對PTM細胞細胞骨架和細胞剛度響應剪切應力的影響
PTM細胞的量化排列被描述為相對于流軸 ±30° 范圍內的細胞比例。對于正常的PTM細胞，如圖2 A、B，暴露于25 dyn/cm2的剪切應力12小時后，與靜態(tài)組相比（無剪切應力），與流向軸（0°）方向角在 -30°至30° 之間的細胞比例明顯增加。相比之下，對于衰老的PTM細胞，與靜態(tài)組相比，暴露于剪切應力后，細胞的百分比沒有顯著變化（圖2 A、B）。這些結果表明，在暴露于25 dyn/cm2的剪切應力12小時內，正常的PTM細胞傾向于向流動方向定向運動，而衰老的PTM細胞則沒有以相同的方式響應。
如圖2 C，與正常PTM細胞相比，這些衰老PTM細胞的F-肌動蛋白含量顯著增加。當細胞暴露于剪切應力時，正常和衰老PTM細胞中的F-肌動蛋白含量均顯著提高。相應地，原子力顯微鏡（AFM）結果表明，PTM細胞的衰老導致細胞剛度增加（圖2 D）。在受到剪切應力后，正常和衰老的PTM細胞都表現出增加的細胞剛度。實驗定量地觀察到，正常和衰老PTM細胞在暴露于剪切應力后，剛度分別增加了67.44% 和 36.14%。正如預期的那樣，同時將 PTM 細胞暴露于高氧和剪切應力下，與對照組相比，細胞剛度發(fā)生了最顯著的變化（圖2 D）。這些結果表明，細胞剛度與F-肌動蛋白含量呈正相關。
衰老對PTM細胞響應剪切應力下的細胞遷移的影響
進行Transwell測定以確定承受剪切應力的正常和衰老PTM細胞的遷移能力。結果發(fā)現，與正常PTM細胞相比，衰老PTM細胞的遷移速率顯著降低。在剪切應力下暴露12 h后，正常PTM細胞的遷移能力比靜態(tài)組顯著提高。然而，對于衰老的PTM細胞則相反。
衰老對PTM細胞響應剪切應力下的MMP、金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMPs）和膠原mRNA表達的影響
RT-PCR結果表明，與靜態(tài)組相比，正常的PTM細胞暴露于剪切應力12 h后，MMP-1，MMP-2，TIMP-1和TIMP-2的mRNA表達顯著上調。然而在衰老的PTM細胞中，除TIMP-1外，這些特定蛋白的mRNA表達均顯著下調。此外，在暴露于剪切應力后，正常和衰老PTM細胞中I型膠原（COLA-1）和IV型膠原（COLA-4）的mRNA表達均未發(fā)生變化。
衰老對PTM細胞響應剪切應力下ERK蛋白表達的影響
最后，實驗還使用蛋白質印跡分析研究了ERK的表達和磷酸化。對于正常的PTM細胞，與靜態(tài)組相比，暴露于剪切應力12小時后p-ERK /總ERK比值顯著增加。相比之下，觀察到暴露于剪切應力12小時后衰老PTM細胞的p-ERK /總ERK比率顯著降低（圖3 A、B）。為了進一步研究衰老對ERK表達和磷酸化的影響，實驗通過應用短期剪切應力，研究了正常和衰老PTM細胞的剪切應力暴露時間依賴性。如圖3 C、D，對于正常的PTM細胞，與靜態(tài)組相比，暴露于剪切應力10分鐘和30分鐘后，p-ERK /總ERK比值大致保持不變。然而，對于衰老的PTM細胞，p-ERK/總ERK比值顯著下降到剪應力暴露后12 h的值，甚至是10分鐘（圖3 C、D）。這些結果表明，在正�；蛩ダ系腜TM細胞中，ERK磷酸化響應剪切應力的改變發(fā)生在不同的時間點。
綜上所述，pTMCs可以通過改變生物力學特性和生理功能來感知和響應剪切應力。然而，細胞衰老改變了機械生物學反應，并且在大多數情況下，使細胞對剪切應力的反應降低，這可能導致細胞TM功能隨著年齡的增長而逐漸衰竭。盡管TMCs的機械生物學很重要，但我們對TMCs在青光眼或衰老中的機械應力反應行為的了解非常有限。這項研究為衰老通過影響TMC功能障礙在調節(jié)眼壓中的作用提供了新的線索，這將加深對POAG病理生理學的理解。
參考文獻：Du R, Li D, Zhu M, Zheng L, Ren K, Han D, Li L, Ji J, Fan Y. Cell senescence alters responses of porcine trabecular meshwork cells to shear stress. Front Cell Dev Biol. 2022 Nov 21;10:1083130. doi: 10.3389/fcell.2022.1083130. PMID: 36478743; PMCID: PMC9721263.
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由IOP驅動的房水的大量流動對常規(guī)的流出通道施加了剪切應力。預計該剪切應力在2-25 dyn/cm2 的范圍內，由于青光眼患者的眼壓升高，該值可能更高�，F有研究表明，TMC可以響應房水流施加的剪切應力，從而提供了一種調節(jié)反饋手段來控制眼壓。
患POAG的風險明顯隨著年齡的增長而增加。TMCs的衰老被認為是POAG發(fā)生或進展的主要危險因素。大量研究表明，細胞衰老可以改變 TMCs 的形態(tài)、細胞骨架、表型和功能的。然而，細胞衰老如何影響TMCs對剪切應力的反應卻鮮為人知。
在這里，生物力學與力生物學教育部重點實驗室、國家納米科學中心、中國科學院力學研究所的一項聯合研究探討了衰老對豬眼小梁（PTM）細胞對剪切應力反應的影響，研究結果表明，細胞衰老損害了PTM細胞對剪切應力的生理反應。
高氧誘導的細胞衰老模型
在這項研究中，研究人員采用了高壓氧治療來誘導衰老細胞。結果發(fā)現，與正常PTM形態(tài) 相比（圖1 A），這些細胞在40% O2中的生長表現出擴大的細胞形態(tài)（圖1 B）。暴露于高氧 2 周后，PTM 細胞的細胞衰老標志物 β-半乳糖苷酶呈陽性（圖1 D），而對照PTM細胞的染色可以忽略不計（圖1 C），如圖1 E所示。此外，流式細胞術結果顯示，與對照組相比（圖1 G），暴露于高氧后，G2/M 期細胞的比例似乎在減少（圖1H）。定量結果顯示在圖1 F。
圖1 高氧作為豬小梁網（PTM）細胞衰老的實驗模型。
在對照（A）或高氧（40% O2）條件（B）下PTM細胞生長2周的形態(tài)。在對照（C）或高氧（40% O2）條件（D）下生長2周的PTM細胞β-半乳糖苷酶染色。在對照條件下生長的PTM細胞對衰老標志物β-半乳糖苷酶的染色可以忽略不計，而暴露于高氧的細胞對該標志物染色呈陽性（E）。與對照組相比，高氧暴露后S期和G2期的細胞比例下降（F）。流式細胞術定量PTM細胞在對照（G）或高氧（40% O2）條件（H）下生長2周的細胞周期。衰老對PTM細胞細胞骨架和細胞剛度響應剪切應力的影響
PTM細胞的量化排列被描述為相對于流軸 ±30° 范圍內的細胞比例。對于正常的PTM細胞，如圖2 A、B，暴露于25 dyn/cm2的剪切應力12小時后，與靜態(tài)組相比（無剪切應力），與流向軸（0°）方向角在 -30°至30° 之間的細胞比例明顯增加。相比之下，對于衰老的PTM細胞，與靜態(tài)組相比，暴露于剪切應力后，細胞的百分比沒有顯著變化（圖2 A、B）。這些結果表明，在暴露于25 dyn/cm2的剪切應力12小時內，正常的PTM細胞傾向于向流動方向定向運動，而衰老的PTM細胞則沒有以相同的方式響應。
如圖2 C，與正常PTM細胞相比，這些衰老PTM細胞的F-肌動蛋白含量顯著增加。當細胞暴露于剪切應力時，正常和衰老PTM細胞中的F-肌動蛋白含量均顯著提高。相應地，原子力顯微鏡（AFM）結果表明，PTM細胞的衰老導致細胞剛度增加（圖2 D）。在受到剪切應力后，正常和衰老的PTM細胞都表現出增加的細胞剛度。實驗定量地觀察到，正常和衰老PTM細胞在暴露于剪切應力后，剛度分別增加了67.44% 和 36.14%。正如預期的那樣，同時將 PTM 細胞暴露于高氧和剪切應力下，與對照組相比，細胞剛度發(fā)生了最顯著的變化（圖2 D）。這些結果表明，細胞剛度與F-肌動蛋白含量呈正相關。
圖2 衰老對PTM細胞細胞骨架和細胞剛度響應剪切應力的影響。
（A）在靜態(tài)條件（無剪切應力）或承受 25 dyn/cm2 剪切應力下正常和衰老 PTM 細胞的熒光圖像。（B）正常和衰老PTM細胞在靜態(tài)條件下或承受剪切應力的細胞骨架排列。（C）正常和衰老PTM細胞在靜態(tài)條件下或承受剪切應力的F-肌動蛋白含量。（D）正常和衰老PTM細胞在靜態(tài)條件下或承受剪切應力的細胞剛度。衰老對PTM細胞響應剪切應力下的細胞遷移的影響
進行Transwell測定以確定承受剪切應力的正常和衰老PTM細胞的遷移能力。結果發(fā)現，與正常PTM細胞相比，衰老PTM細胞的遷移速率顯著降低。在剪切應力下暴露12 h后，正常PTM細胞的遷移能力比靜態(tài)組顯著提高。然而，對于衰老的PTM細胞則相反。
衰老對PTM細胞響應剪切應力下的MMP、金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMPs）和膠原mRNA表達的影響
RT-PCR結果表明，與靜態(tài)組相比，正常的PTM細胞暴露于剪切應力12 h后，MMP-1，MMP-2，TIMP-1和TIMP-2的mRNA表達顯著上調。然而在衰老的PTM細胞中，除TIMP-1外，這些特定蛋白的mRNA表達均顯著下調。此外，在暴露于剪切應力后，正常和衰老PTM細胞中I型膠原（COLA-1）和IV型膠原（COLA-4）的mRNA表達均未發(fā)生變化。
衰老對PTM細胞響應剪切應力下ERK蛋白表達的影響
最后，實驗還使用蛋白質印跡分析研究了ERK的表達和磷酸化。對于正常的PTM細胞，與靜態(tài)組相比，暴露于剪切應力12小時后p-ERK /總ERK比值顯著增加。相比之下，觀察到暴露于剪切應力12小時后衰老PTM細胞的p-ERK /總ERK比率顯著降低（圖3 A、B）。為了進一步研究衰老對ERK表達和磷酸化的影響，實驗通過應用短期剪切應力，研究了正常和衰老PTM細胞的剪切應力暴露時間依賴性。如圖3 C、D，對于正常的PTM細胞，與靜態(tài)組相比，暴露于剪切應力10分鐘和30分鐘后，p-ERK /總ERK比值大致保持不變。然而，對于衰老的PTM細胞，p-ERK/總ERK比值顯著下降到剪應力暴露后12 h的值，甚至是10分鐘（圖3 C、D）。這些結果表明，在正�；蛩ダ系腜TM細胞中，ERK磷酸化響應剪切應力的改變發(fā)生在不同的時間點。
圖3 衰老對PTM細胞響應剪切應力下的細胞外信號調節(jié)激酶（ERK）和p-ERK表達的影響。
（A、B）在靜態(tài)條件下或承受12小時剪切應力下正常和衰老PTM細胞的p-ERK和ERK表達的蛋白質印跡分析。（C、D）在靜態(tài)條件下或經受 10 分鐘和 30 分鐘剪切應力下正常和衰老 PTM 細胞的 p-ERK/總ERK 蛋白表達的蛋白質印跡分析。綜上所述，pTMCs可以通過改變生物力學特性和生理功能來感知和響應剪切應力。然而，細胞衰老改變了機械生物學反應，并且在大多數情況下，使細胞對剪切應力的反應降低，這可能導致細胞TM功能隨著年齡的增長而逐漸衰竭。盡管TMCs的機械生物學很重要，但我們對TMCs在青光眼或衰老中的機械應力反應行為的了解非常有限。這項研究為衰老通過影響TMC功能障礙在調節(jié)眼壓中的作用提供了新的線索，這將加深對POAG病理生理學的理解。
參考文獻：Du R, Li D, Zhu M, Zheng L, Ren K, Han D, Li L, Ji J, Fan Y. Cell senescence alters responses of porcine trabecular meshwork cells to shear stress. Front Cell Dev Biol. 2022 Nov 21;10:1083130. doi: 10.3389/fcell.2022.1083130. PMID: 36478743; PMCID: PMC9721263.
小編旨在分享、學習、交流生物科學等領域的研究進展。如有侵權或引文不當請聯系小編修正。
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