MIQE指南：RT-qPCR中的逆轉(zhuǎn)錄詳解

1、前言

逆轉(zhuǎn)錄是以RNA為模板合成DNA的過程，即RNA指導(dǎo)下的DNA合成。在逆轉(zhuǎn)錄過程中必不可少的逆轉(zhuǎn)錄酶，除了其依賴RNA的DNA聚合酶活性，還需要鎂離子或錳離子等輔助因子，同時包括依賴于DNA的DNA聚合酶活性和RNase H活性，它可以降解DNA與RNA雜交鏈中的RNA鏈。與典型的DNA聚合酶不同，逆轉(zhuǎn)錄酶缺乏校對功能，在PCR實驗中逆轉(zhuǎn)錄酶存在抑制Taq聚合酶活性的功能，進而導(dǎo)致不準(zhǔn)確的測定結(jié)果。
 

目前，最常用的逆轉(zhuǎn)錄酶類型有兩種，一是來自禽類成髓細胞瘤病毒（AMV）的逆轉(zhuǎn)錄酶，二是來自莫洛尼小鼠白血病病毒（M-MLV）的逆轉(zhuǎn)錄酶。AMV逆轉(zhuǎn)錄酶相對于其他類型的逆轉(zhuǎn)錄酶，它更具有加工性，具有更高的最佳活性溫度范圍（42~48°C），更適合逆轉(zhuǎn)錄具有較強二級結(jié)構(gòu)的RNA。然而，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶具有相對較高的RNase H活性，這使其在合成長轉(zhuǎn)錄本方面的作用較小。相比之下，M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶是由一個單一的亞基組成，具有較低的RNase H活性，由于這些特性，M-MLV RT經(jīng)常被用于較長的轉(zhuǎn)錄本。M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶最適活性溫度為37°C。許多M-MLV變體是可用的，包括RNase H點突變體，它們更耐熱，更適合復(fù)雜困難的模板。
 

2、工作流程和用途

逆轉(zhuǎn)錄可用于生成適合各種下游應(yīng)用的cDNA。

▲ 圖1 RNA工作流程
 

在某些情況下，逆轉(zhuǎn)錄和實時熒光定量PCR在一個單一的反應(yīng)混合液中反應(yīng)時，稱為一步法RT-qPCR。當(dāng)逆轉(zhuǎn)錄和實時PCR在不同的反應(yīng)混合液中發(fā)生時，被稱為兩步法RT-qPCR。
 

▲ 圖2 兩步法RT-qPCR工作流程
 

當(dāng)需要大量cDNA通過PCR或qPCR研究多個轉(zhuǎn)錄本時，兩步法是首選。在一步法RT-qPCR中，目標(biāo)序列在同一反應(yīng)孔或容器中進行逆轉(zhuǎn)錄和qPCR擴增。用隨機引物或oligo（dT）引物代替目標(biāo)特異性引物。一步法RT-qPCR相對于兩步法RT-qPCR需要的樣本更少。此外，任何技術(shù)重復(fù)之間的方差都可以用來評估這兩個酶促步驟的聯(lián)合可變性。一步法RT- qPCR經(jīng)常被用于RNA的定量和質(zhì)量控制。一步法可能的劣勢在于引物設(shè)計更復(fù)雜，因為引物必須在逆轉(zhuǎn)錄和PCR溫度下同時發(fā)揮作用。

3、考量點

理想情況下，每一個靶向轉(zhuǎn)錄的RNA或mRNA分子都將轉(zhuǎn)化為一個cDNA分子，即所有的靶RNA都將以相同的效率轉(zhuǎn)錄。然而，RT效率的可變性，無論是由于RNA樣本質(zhì)量、引物設(shè)計、RT酶的選擇，還是其他因素，都會影響所產(chǎn)生的代表RNA分子在樣本中的分布程度的cDNA。RT效率的變化是在RT-qPCR反應(yīng)總體結(jié)果質(zhì)量中一個被嚴重低估的因素，其影響已延伸到大量已發(fā)表的基因表達研究。MIQE指南中概述的如樣本、核酸提取和逆轉(zhuǎn)錄細節(jié)，均是為了可以獲得有效的RT-qPCR結(jié)果。成功的逆轉(zhuǎn)錄考量參數(shù)有以下幾點：

RNA純化和純度：

在選擇RNA提取方法時，需要考慮許多參數(shù)，但理想情況下，RNA樣本應(yīng)該不受污染蛋白質(zhì)，如核酸酶，這可能會干擾cDNA合成和下游應(yīng)用。產(chǎn)量是一個主要的考慮因素，然而，有效地去除基因組DNA（gDNA）同樣重要。即使是少量的gDNA污染也會導(dǎo)致qPCR結(jié)果的可變性，而大量的gDNA污染也會導(dǎo)致直接的定量錯誤。減少對gDNA污染一種方法是在RNA分離方法中加入一個DNase酶消化的步驟。此外，應(yīng)使用無逆轉(zhuǎn)錄酶對照（無RT）來確定RNA樣本中是否存在gDNA。

RNA完整性：

RNA樣本的完整性對于許多下游應(yīng)用都是至關(guān)重要的。完整的真核生物的RNA一個重要特征是同時存在28S和18S核糖體RNA（rRNA）（圖3）。這些條帶的存在和整體RNA質(zhì)量可以通過瓊脂糖凝膠電泳和其他方法來評估。理想情況下，在瓊脂糖凝膠上顯示時，28S帶的亮度應(yīng)該是18S帶的兩倍，盡管大致相等的亮度也可以表明RNA在大多數(shù)應(yīng)用中具有足夠高的質(zhì)量。
 

▲ 圖3：RNA完整性電泳圖，RNA降解導(dǎo)致拖帶現(xiàn)象
 

逆轉(zhuǎn)錄引物：

cDNA合成通常涉及使用三種引物中的一種：Oligo（dT）引物、隨機引物（Random primer）或基因特異性引物。隨機引物是一種隨機序列的短寡核苷酸，對于長（>4kb）或缺乏poly (A)尾巴的轉(zhuǎn)錄本，如原核mRNA的情況，它們可以在轉(zhuǎn)錄本的多個點上啟動逆轉(zhuǎn)錄，因此，它們對于長mRNA和具有重要二級結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄本很有用。通常使用隨機六聚體引物，使用隨機八或九聚體引物可以促進更長的cDNA合成，因為它們雜交的頻率較低�；�因特異性引物通常用于一步（偶聯(lián)）RT-PCR。這些方法通過將所有逆轉(zhuǎn)錄酶活性引導(dǎo)到特定的信息，而不是轉(zhuǎn)錄整個RNA來提高敏感性。對于目標(biāo)擴增子長度約為100bp或以下的RT-qPCR應(yīng)用，使用更高濃度的隨機引物可能是有利的。設(shè)計跨越內(nèi)含子或內(nèi)含子-外顯子邊界的引物可以確保cDNA是由剪接的mRNA序列合成的，而不是gDNA中的親本基因序列合成。經(jīng)過生物素修飾或在5‘端添加序列標(biāo)簽等修飾的引物可用于純化和/或分析由特定義或反義模板鏈合成的cDNA。
 

RNA的二級結(jié)構(gòu)：

RNA分子具有影響逆轉(zhuǎn)錄的二級結(jié)構(gòu)，而高GC含量會降低逆轉(zhuǎn)錄效率。在逆轉(zhuǎn)錄或cDNA合成前高溫變性處理，可能有利于困難模板的逆轉(zhuǎn)錄。RNA可以通過在65°C下變性5分鐘來打開其二級結(jié)構(gòu)。
 

cDNA的qPCR定量：

強烈建議在cDNA合成后進行RT酶的熱失活處理。RT酶失活后，要么直接通過qPCR對cDNA進行目標(biāo)特異性的定量分析，要么將滅活的反應(yīng)液冷凍保存，直到需要時才使用。qPCR反應(yīng)混合物通常可容納cDNA樣本體積的增加，最高可占總反應(yīng)體積的20%。cDNA可以作為未稀釋的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物直接添加到qPCR中，也可以稀釋后進行qPCR反應(yīng)。cDNA的定量是RT-qPCR工作流程成功的關(guān)鍵。一般來說，作為模板的cDNA的量不應(yīng)超過投入100ng總RNA逆轉(zhuǎn)錄后所得的量。由高度豐富的轉(zhuǎn)錄本產(chǎn)生的cDNA可以在不到1pg的總RNA中檢測到。
 

4、總結(jié)

逆轉(zhuǎn)錄是RT-qPCR和其他廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵步驟，我們必須仔細考慮RNA模板質(zhì)量和實驗設(shè)計細節(jié)，并清楚了解RT效率和RT偏差程度等性能特征。MIQE指南提供了一個實驗設(shè)計細節(jié)框架，遵循相應(yīng)準(zhǔn)則可以獲得有效且準(zhǔn)確的RT-qPCR結(jié)果。