基于動態(tài)DNA甲基化圖譜觀察脂肪形成過程中的細胞譜系特異性發(fā)育
2016年10月，溫州醫(yī)科大學檢驗醫(yī)學院（生命科學學院）丁春明研究員及團隊在《Molecular Metabolism》雜志發(fā)表題為“Dynamic DNA methylation landscape defines brown and white cell specificity during adipogenesis”的研究文章，該研究通過簡化基因組甲基化測序（RRBS）及對應的轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）揭示了脂肪形成過程中棕色細胞（BAT）和白色細胞（WAT）的特異性發(fā)育。
標題：Dynamic DNA methylation landscape defines brown and white cell specificity during adipogenesis基于動態(tài)DNA甲基化圖譜觀察脂肪形成過程中棕色和白色細胞的特異性
時間：2016-10
期刊：Molecular Metabolism
影響因子：IF 8.568
技術(shù)平臺：RRBS、RNA-seq、qPCR等
研究目的：
白色脂肪組織(white adipose tissues，WAT)主要是在饑餓期間以甘油三酯的形式儲存能量以提供燃料，而棕色脂肪組織(brown adipose tissues，BAT)則是非寒戰(zhàn)產(chǎn)熱的主要器官，最近研究也表明了第三種脂肪細胞的存在，即米色脂肪細胞。為闡明WAT和BAT細胞譜系特異性發(fā)育的分子機制被視為脂肪生物學研究的關(guān)鍵領(lǐng)域，本研究分析了WAT和BAT在分化過程中的DNA甲基化組，并認為DNA甲基化可能是確定脂肪細胞譜系中一個穩(wěn)定的表觀遺傳因素。
項目設(shè)計：
（1）樣本選�。�
以從BL6小鼠肩胛間區(qū)和腹股溝區(qū)脂肪組織中分離出的WAT和BAT為樣本。
（2）項目設(shè)計流程圖：
3、實驗結(jié)果
（1）脂肪形成模型的DNA甲基化概況
從8只BL6小鼠肩胛間區(qū)和腹股溝區(qū)的脂肪組織中分離出WAT和BAT，并用去甲腎上腺素(NE)處理WAT5天，用NE急性處理BAT4小時，以誘導關(guān)鍵標記物的表達。通過實時定量PCR檢測各模型在不同分化階段的泛成脂標記(AdipoQ、Fabp4、Pparg)和特異性標記(Pgc1a、Ucp1、Cidea)的表達，驗證各模型的生物學有效性。此外，為探究DNA甲基組和轉(zhuǎn)錄組可能編碼的生物信息，研究人員對這兩個數(shù)據(jù)集進行了主成分分析和層次聚類，揭示了樣品的分化狀態(tài)與脂質(zhì)代謝的功能專一化有關(guān)。值得注意的是，WAT和BAT的NE處理并沒有改變它們基于DNA甲基化的聚類模式。因此，研究人員認為DNA甲基化標記代表了不同細胞系穩(wěn)定的表觀遺傳標記。
（2）DNA甲基化組在脂肪形成過程中的變化
在單個CpG和基因組水平的分化過程中檢測DNA甲基化譜的變化。首先，所有被分析的CpG被分為低甲基化(LM)、部分甲基化(PM)和高甲基化(HM)三類。在WAT和BAT形成過程中，LM的CpGs降低，而PM和HM的CpGs相應增加。對每個CpG甲基化差異的評估顯示，高甲基化CpG的豐度始終高于低甲基化CpG。這表明，在WAT和BAT脂肪形成過程中DNA甲基化的整體增加。盡管大多數(shù)顯著差異甲基化的CPG(DMC)位于內(nèi)含子和基因間區(qū)域，但高甲基化的CPG在啟動子區(qū)域最為顯著。有趣的是，WAT和BAT形成過程中顯著差異甲基化啟動子(DMP)的獨立功能富集分析(第0天和第4天)顯示，細胞增殖和分化顯著富集。
（3）BAT和WAT在脂肪形成過程中的系統(tǒng)差異
BAT和WAT的時間匹配比較顯示高甲基化的CPG明顯高于低甲基化的CPG。與脂肪形成時間過程分析的結(jié)果相似，顯著甲基化CPG(DMCs)大多位于內(nèi)含子或基因間區(qū)域。然而，與脂肪形成時間過程分析不同的是，低甲基化DMC(相對于WAT)在外顯子區(qū)域占主導地位。
（4）啟動子甲基化與基因表達普遍呈負相關(guān)
本研究從RNA-seq數(shù)據(jù)中獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對BAT和WAT形成過程中受調(diào)控的基因進行GO分析，發(fā)現(xiàn)BAT和WAT形成過程中受調(diào)控的基因分別在線粒體呼吸鏈和脂質(zhì)代謝過程中顯著富集，相對于成熟WAT，成熟BAT中GO的最高上調(diào)為線粒體呼吸鏈和脂肪酸氧化。在比較WAT和BAT兩種類型以及不同時間形成脂肪的細胞時，發(fā)現(xiàn)啟動子甲基化與基因表達呈整體負相關(guān)。
（5）Hox家族基因在棕色和白色脂肪形成中甲基化的差異一致
當比較BAT和WAT在脂肪形成的所有三個時間點時，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了31個DNA甲基化顯著變化的基因，WAT與BAT相比，分別有23個高甲基化和8個低甲基化，其中一類重要的轉(zhuǎn)錄因子Hox家族基因顯著富集，包括Hoxa2、Hoxa5、Hoxc4、Hoxc9和Hoxc10。Hox基因成員是轉(zhuǎn)錄因子的一個超家族，在序列和功能上都高度保守。有趣的是，對于所有這5個Hox基因，RNA-seq的基因表達與甲基化模式呈負相關(guān)。Hoxa2、Hoxa5和Hoxc4在BAT中富集，這與它們的高甲基化是一致的，而Hoxc9和Hoxc10在BAT中表達較低，這與它們的低甲基化是一致的。
為了測試這些基因在小鼠和人類之間的表達模式是否保守，本研究檢查了從成人皮下和胎兒棕色脂肪中獲得的RNA-seq數(shù)據(jù)。與小鼠體外和體內(nèi)模型一致，Hoxc9和Hoxc10在人類中表現(xiàn)出組織特異性表達。
（6）5- Aza-cytidine對Hox基因啟動子DNA甲基化的抑制可上調(diào)基因表達
最后，研究在甲基化阻斷劑5-Aza-cytidine的作用下誘導白色和棕色前脂肪細胞分化五天。在5- Aza-cytidine誘導的去甲基化過程中，Hoxa2和Hoxa5在其啟動子高甲基化的WAT中顯著上調(diào)，而在其啟動子低甲基化的BAT中則不上調(diào)。Hoxc9和Hoxc10在BAT中的上調(diào)程度高于WAT，可能與它們在BAT中的高甲基化有關(guān)。Hoxc10被選擇作進一步分析，因為它在去甲基化時表現(xiàn)出最顯著的表達變化，最近的數(shù)據(jù)表明它是WAT中BAT標記物表達的抑制因子。在另一個單獨的實驗中，用5-Aza處理分化成熟的棕色脂肪細胞3天，在這兩種情況下都檢測到Hoxc10的上調(diào)，這表明去甲基化導致Hoxc10上調(diào)可能是一種因果作用，與分化過程無關(guān)。
關(guān)鍵圖形
Figure 3: Promoter methylation differences for five Hox genes were associated with gene expression differences between white and brown adipocytes during adipogenesis.
Figure 4: Inhibition of DNA methylation in Hox gene promoters by 5 Aza-cytidine treatment alters gene expression.
結(jié)論
本研究通過RRBS、RNA-seq等組學分析表明，DNA甲基化是分化前、分化過程中和分化后棕色和白色細胞譜系的穩(wěn)定表觀遺傳特征。本研究共鑒定出31個基因的啟動子在分化的所有三個時間點在白色和棕色脂肪形成之間的顯著差異甲基化。其中五個基因?qū)儆贖ox家族，其表達水平與啟動子甲基化呈負相關(guān)，表明DNA甲基化在轉(zhuǎn)錄中的調(diào)控作用。用5- Aza-cytidine阻斷DNA甲基化導致這些基因表達上調(diào)，對Hoxc10（BAT標記物表達抑制因子）具有顯著作用。總之，研究數(shù)據(jù)表明，DNA甲基化可能在脂肪細胞的譜系特異性發(fā)育中發(fā)揮重要作用。
參考文獻：
Lim YC, Chia SY, Jin S, Han W, Ding C, Sun L. Dynamic DNA methylation landscape defines brown and white cell specificity during adipogenesis. Mol Metab. 2016 Oct;5(10):1033-1041.
標題：Dynamic DNA methylation landscape defines brown and white cell specificity during adipogenesis基于動態(tài)DNA甲基化圖譜觀察脂肪形成過程中棕色和白色細胞的特異性時間：2016-10
期刊：Molecular Metabolism
影響因子：IF 8.568
技術(shù)平臺：RRBS、RNA-seq、qPCR等
研究目的：
白色脂肪組織(white adipose tissues，WAT)主要是在饑餓期間以甘油三酯的形式儲存能量以提供燃料，而棕色脂肪組織(brown adipose tissues，BAT)則是非寒戰(zhàn)產(chǎn)熱的主要器官，最近研究也表明了第三種脂肪細胞的存在，即米色脂肪細胞。為闡明WAT和BAT細胞譜系特異性發(fā)育的分子機制被視為脂肪生物學研究的關(guān)鍵領(lǐng)域，本研究分析了WAT和BAT在分化過程中的DNA甲基化組，并認為DNA甲基化可能是確定脂肪細胞譜系中一個穩(wěn)定的表觀遺傳因素。
項目設(shè)計：
（1）樣本選�。�
以從BL6小鼠肩胛間區(qū)和腹股溝區(qū)脂肪組織中分離出的WAT和BAT為樣本。
（2）項目設(shè)計流程圖：
3、實驗結(jié)果
（1）脂肪形成模型的DNA甲基化概況
從8只BL6小鼠肩胛間區(qū)和腹股溝區(qū)的脂肪組織中分離出WAT和BAT，并用去甲腎上腺素(NE)處理WAT5天，用NE急性處理BAT4小時，以誘導關(guān)鍵標記物的表達。通過實時定量PCR檢測各模型在不同分化階段的泛成脂標記(AdipoQ、Fabp4、Pparg)和特異性標記(Pgc1a、Ucp1、Cidea)的表達，驗證各模型的生物學有效性。此外，為探究DNA甲基組和轉(zhuǎn)錄組可能編碼的生物信息，研究人員對這兩個數(shù)據(jù)集進行了主成分分析和層次聚類，揭示了樣品的分化狀態(tài)與脂質(zhì)代謝的功能專一化有關(guān)。值得注意的是，WAT和BAT的NE處理并沒有改變它們基于DNA甲基化的聚類模式。因此，研究人員認為DNA甲基化標記代表了不同細胞系穩(wěn)定的表觀遺傳標記。
（2）DNA甲基化組在脂肪形成過程中的變化
在單個CpG和基因組水平的分化過程中檢測DNA甲基化譜的變化。首先，所有被分析的CpG被分為低甲基化(LM)、部分甲基化(PM)和高甲基化(HM)三類。在WAT和BAT形成過程中，LM的CpGs降低，而PM和HM的CpGs相應增加。對每個CpG甲基化差異的評估顯示，高甲基化CpG的豐度始終高于低甲基化CpG。這表明，在WAT和BAT脂肪形成過程中DNA甲基化的整體增加。盡管大多數(shù)顯著差異甲基化的CPG(DMC)位于內(nèi)含子和基因間區(qū)域，但高甲基化的CPG在啟動子區(qū)域最為顯著。有趣的是，WAT和BAT形成過程中顯著差異甲基化啟動子(DMP)的獨立功能富集分析(第0天和第4天)顯示，細胞增殖和分化顯著富集。
（3）BAT和WAT在脂肪形成過程中的系統(tǒng)差異
BAT和WAT的時間匹配比較顯示高甲基化的CPG明顯高于低甲基化的CPG。與脂肪形成時間過程分析的結(jié)果相似，顯著甲基化CPG(DMCs)大多位于內(nèi)含子或基因間區(qū)域。然而，與脂肪形成時間過程分析不同的是，低甲基化DMC(相對于WAT)在外顯子區(qū)域占主導地位。
（4）啟動子甲基化與基因表達普遍呈負相關(guān)
本研究從RNA-seq數(shù)據(jù)中獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對BAT和WAT形成過程中受調(diào)控的基因進行GO分析，發(fā)現(xiàn)BAT和WAT形成過程中受調(diào)控的基因分別在線粒體呼吸鏈和脂質(zhì)代謝過程中顯著富集，相對于成熟WAT，成熟BAT中GO的最高上調(diào)為線粒體呼吸鏈和脂肪酸氧化。在比較WAT和BAT兩種類型以及不同時間形成脂肪的細胞時，發(fā)現(xiàn)啟動子甲基化與基因表達呈整體負相關(guān)。
（5）Hox家族基因在棕色和白色脂肪形成中甲基化的差異一致
當比較BAT和WAT在脂肪形成的所有三個時間點時，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了31個DNA甲基化顯著變化的基因，WAT與BAT相比，分別有23個高甲基化和8個低甲基化，其中一類重要的轉(zhuǎn)錄因子Hox家族基因顯著富集，包括Hoxa2、Hoxa5、Hoxc4、Hoxc9和Hoxc10。Hox基因成員是轉(zhuǎn)錄因子的一個超家族，在序列和功能上都高度保守。有趣的是，對于所有這5個Hox基因，RNA-seq的基因表達與甲基化模式呈負相關(guān)。Hoxa2、Hoxa5和Hoxc4在BAT中富集，這與它們的高甲基化是一致的，而Hoxc9和Hoxc10在BAT中表達較低，這與它們的低甲基化是一致的。
為了測試這些基因在小鼠和人類之間的表達模式是否保守，本研究檢查了從成人皮下和胎兒棕色脂肪中獲得的RNA-seq數(shù)據(jù)。與小鼠體外和體內(nèi)模型一致，Hoxc9和Hoxc10在人類中表現(xiàn)出組織特異性表達。
（6）5- Aza-cytidine對Hox基因啟動子DNA甲基化的抑制可上調(diào)基因表達
最后，研究在甲基化阻斷劑5-Aza-cytidine的作用下誘導白色和棕色前脂肪細胞分化五天。在5- Aza-cytidine誘導的去甲基化過程中，Hoxa2和Hoxa5在其啟動子高甲基化的WAT中顯著上調(diào)，而在其啟動子低甲基化的BAT中則不上調(diào)。Hoxc9和Hoxc10在BAT中的上調(diào)程度高于WAT，可能與它們在BAT中的高甲基化有關(guān)。Hoxc10被選擇作進一步分析，因為它在去甲基化時表現(xiàn)出最顯著的表達變化，最近的數(shù)據(jù)表明它是WAT中BAT標記物表達的抑制因子。在另一個單獨的實驗中，用5-Aza處理分化成熟的棕色脂肪細胞3天，在這兩種情況下都檢測到Hoxc10的上調(diào)，這表明去甲基化導致Hoxc10上調(diào)可能是一種因果作用，與分化過程無關(guān)。
關(guān)鍵圖形
Figure 3: Promoter methylation differences for five Hox genes were associated with gene expression differences between white and brown adipocytes during adipogenesis.Figure 4: Inhibition of DNA methylation in Hox gene promoters by 5 Aza-cytidine treatment alters gene expression.結(jié)論
本研究通過RRBS、RNA-seq等組學分析表明，DNA甲基化是分化前、分化過程中和分化后棕色和白色細胞譜系的穩(wěn)定表觀遺傳特征。本研究共鑒定出31個基因的啟動子在分化的所有三個時間點在白色和棕色脂肪形成之間的顯著差異甲基化。其中五個基因?qū)儆贖ox家族，其表達水平與啟動子甲基化呈負相關(guān)，表明DNA甲基化在轉(zhuǎn)錄中的調(diào)控作用。用5- Aza-cytidine阻斷DNA甲基化導致這些基因表達上調(diào)，對Hoxc10（BAT標記物表達抑制因子）具有顯著作用。總之，研究數(shù)據(jù)表明，DNA甲基化可能在脂肪細胞的譜系特異性發(fā)育中發(fā)揮重要作用。
參考文獻：
Lim YC, Chia SY, Jin S, Han W, Ding C, Sun L. Dynamic DNA methylation landscape defines brown and white cell specificity during adipogenesis. Mol Metab. 2016 Oct;5(10):1033-1041.
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