血液4D-DIA蛋白組項(xiàng)目文章NC（IF 17.69）:PBC早期診斷和干預(yù)中的應(yīng)用

原發(fā)性膽管炎(PBC)是一種慢性自身免疫性肝病,全世界每年有超過(guò)10萬(wàn)例PBC新確診病例。病理上顯示PBC最初破壞肝內(nèi)小膽管中的膽道上皮細(xì)胞(BECs)，臨床上表現(xiàn)為出現(xiàn)抗線粒體抗體(AMA)。之前的研究表明進(jìn)行性體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)可破壞BECs，但是自身免疫反應(yīng)破壞PBC患者肝臟中的小BECs的機(jī)制，及在PBC發(fā)病的早期階段BECs的靶點(diǎn)目前尚不清楚。此外，之前的研究發(fā)現(xiàn)聚合免疫球蛋白受體（pIgR）可引起B(yǎng)EC的凋亡和膽道損傷，但是pIgR是否或如何參與PBC的發(fā)展和進(jìn)展，尤其是在PBC發(fā)病的早期階段也不清楚。
 

2023年2月9日，第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院(西南醫(yī)院)消化內(nèi)科兼膽汁淤積性肝病中心柴進(jìn)教授團(tuán)隊(duì)在Nature Communications（IF 17.694）發(fā)表了題目為“Unique DUOX2⁺ACE2⁺small cholangiocytes are pathogenic targets for primary biliary cholangitis”的研究成果，該研究利用單細(xì)胞RNA測(cè)序、流式分選(FACS)等方法，在人和小鼠肝臟中鑒定了一種獨(dú)特類型的DUOX2⁺ACE2⁺小膽管細(xì)胞。作者還通過(guò)血液蛋白質(zhì)組學(xué)、qRCR等方法發(fā)現(xiàn)pIgR在DUOX2⁺ACE2⁺膽管細(xì)胞中高度表達(dá)。研究證實(shí)高表達(dá)pIgR抗原的DUOX2⁺ACE2⁺小膽管細(xì)胞是PBC的致病靶點(diǎn)。中科新生命為該研究提供血液4D-DIA蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)服務(wù)。

 

 研究材料

對(duì)照組和PBC患者肝臟樣本和血清樣本、小鼠肝臟樣本

 

技術(shù)路線

步驟1：PBC肝臟單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜；

步驟2：獨(dú)特DUOX2⁺ACE2⁺小膽管細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)；

步驟3： DUOX2⁺ACE2⁺小膽管細(xì)胞在PBC中的功能及臨床意義研究；

步驟4：尋找與DUOX2⁺ACE2⁺小膽管細(xì)胞損傷有關(guān)的免疫細(xì)胞；

步驟5：尋找與DUOX2⁺ACE2⁺小膽管細(xì)胞損傷有關(guān)的免疫細(xì)胞中關(guān)鍵蛋白。

 

 研究?jī)?nèi)容

1. PBC肝臟單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜

作者對(duì)4名對(duì)照組受試者（CTR）和5名PBC患者的肝臟進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析（圖1a），質(zhì)控后共獲得70,050個(gè)肝細(xì)胞。UMAP（統(tǒng)一流形逼近與投影）分析顯示共鑒定到30個(gè)細(xì)胞群(圖1b)，分為11種細(xì)胞類型(圖1d)。細(xì)胞類型差異分析發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，PBC肝臟中內(nèi)皮細(xì)胞、膽管細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞的比例減少，而T細(xì)胞和漿細(xì)胞的比例增加（圖1g-1h）。

圖1 肝細(xì)胞的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜

 

2. 在人類和小鼠肝臟中發(fā)現(xiàn)獨(dú)特的DUOX2⁺ACE2⁺小膽管細(xì)胞

由于PBC的特點(diǎn)是選擇性破壞小BECs，作者進(jìn)一步分析了膽管細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)膽管細(xì)胞共分為8個(gè)簇(圖2a-2b)，其中膽管細(xì)胞簇（3）僅在對(duì)照組中被檢測(cè)到，而未在PBC肝臟中檢測(cè)到（圖2c-2d）。此外，膽管細(xì)胞簇（3）的雙氧化酶2 (DUOX2)和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2 (ACE2)呈現(xiàn)高表達(dá)的狀態(tài)（在其他膽管細(xì)胞簇中表達(dá)非常低）（圖2e-2f），這表明人類肝臟中有一個(gè)獨(dú)特的膽管細(xì)胞亞群是PBC的潛在靶點(diǎn)。接下來(lái)，作者通過(guò)流式細(xì)胞分選、RNAscope、qPCR等方法證實(shí)肝細(xì)胞高表達(dá)CK19、DUOX2和ACE2，且高表達(dá)膽管細(xì)胞特異性標(biāo)記物、高表達(dá)小膽管細(xì)胞的標(biāo)記基因（圖2g-2j），故作者將膽管細(xì)胞簇（3）定義為DUOX2⁺ACE2⁺膽管細(xì)胞。

圖2 DUOX2⁺ACE2⁺小膽管細(xì)胞的鑒定

 

3. DUOX2⁺ACE2⁺小膽管細(xì)胞在PBC中的功能及臨床意義研究

KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)與其他膽管細(xì)胞簇相比，DUOX2⁺ACE2⁺小膽管細(xì)胞中膽汁分泌通路顯著富集(圖3a)。且肝臟切片RNAscope和多重IF分析顯示，與對(duì)照組相比，PBC患者小膽管中DUOX2⁺ACE2⁺小膽管細(xì)胞的數(shù)量顯著減少(圖3b-e)。此外，DUOX2⁺ACE2⁺小膽管細(xì)胞數(shù)量的減少與PBC的嚴(yán)重程度顯著相關(guān)（圖3f）。另外，在AMA-M2陽(yáng)性或AMA-M2陰性的PBC患者中，肝臟DUOX2⁺ACE2⁺小膽管細(xì)胞數(shù)量顯著減少，但在阻塞性膽汁淤積癥(OC)、繼發(fā)性硬化性膽管炎(SSC)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)患者中則沒有(圖3g)。綜上所述，PBC中肝臟DUOX2⁺ACE2⁺小膽管細(xì)胞數(shù)量顯著減少與膽汁分泌障礙和PBC嚴(yán)重程度密切相關(guān)。

圖3 DUOX2⁺ACE2⁺小膽管細(xì)胞數(shù)量的減少與膽汁分泌障礙和PBC嚴(yán)重程度顯著相關(guān)

 

4. CD27+記憶B細(xì)胞和漿細(xì)胞聚集在PBC患者的肝門靜脈區(qū)，并與DUOX2⁺ACE2⁺小膽管細(xì)胞相互作用

眾所周知，PBC是由自身免疫介導(dǎo)的膽道損傷引起的。為了研究哪些免疫細(xì)胞浸潤(rùn)與DUOX2⁺ACE2⁺小膽管細(xì)胞損傷有關(guān)，作者使用蘇木精-伊紅(HE)(圖4a)、空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)(ST)(圖4b-e)和多重IF分析(圖4f)對(duì)照組和PBC患者的冷凍肝臟切片進(jìn)行分析。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，PBC肝切片中B細(xì)胞、漿細(xì)胞和T細(xì)胞比例增加（圖4c），PBC肝門靜脈區(qū)位置B細(xì)胞和漿細(xì)胞浸潤(rùn)明顯增加、單核細(xì)胞和NK細(xì)胞比例明顯降低(圖4d-4e)、DUOX2⁺ACE2⁺小膽管細(xì)胞數(shù)量顯著減少而B細(xì)胞和漿細(xì)胞數(shù)量顯著增加（圖4f）、CD27+記憶B細(xì)胞數(shù)量顯著增加（圖4f）。此外，與對(duì)照組相比，PBC患者的漿細(xì)胞克隆擴(kuò)增增加(圖4g)。接下來(lái)，作者使用CellPhoneDB分析了DUOX2⁺ACE2⁺小膽管細(xì)胞與免疫細(xì)胞之間的潛在相互作用。結(jié)果顯示配體與DUOX2⁺ACE2⁺小膽管細(xì)胞和免疫細(xì)胞表達(dá)的受體之間存在顯著的相互作用(圖5a-c)。綜上所述，PBC發(fā)病過(guò)程中，免疫應(yīng)答與肝臟DUOX2⁺ACE2⁺小膽管細(xì)胞數(shù)量的選擇性減少有關(guān)，也可能通過(guò)細(xì)胞-細(xì)胞相互作用影響其他類型的膽管細(xì)胞。

圖4 CD27+記憶B和漿細(xì)胞在PBC患者肝門靜脈區(qū)聚集

圖5 DUOX2⁺ACE2⁺小膽管細(xì)胞與免疫細(xì)胞的相互作用

 

5. PBC患者肝臟pIgR在DUOX2⁺ACE2⁺小膽管細(xì)胞中高表達(dá)，血清抗pIgR抗體水平明顯升高

為了研究漿細(xì)胞產(chǎn)生的自身抗體與肝臟DUOX2⁺ACE2⁺小膽管細(xì)胞損傷的關(guān)系，作者對(duì)對(duì)照組和PBC患者的血清樣本進(jìn)行4D-DIA蛋白質(zhì)組學(xué)分析（未去除血清高豐度蛋白） (圖6a-6b)。血清蛋白質(zhì)組學(xué)共定量到2805個(gè)蛋白，其中50個(gè)蛋白顯著上調(diào)、87個(gè)蛋白顯著下調(diào)（PBS/TCR）(圖6c)。顯著差異分析和火山圖結(jié)果顯示PBC患者血清pIgR水平明顯高于對(duì)照組（圖6d-6e）, PBC患者血清抗pIgR抗體水平也顯著升高(圖6f)。對(duì)人類和/或小鼠肝細(xì)胞的進(jìn)一步分析顯示，在DUOX2⁺ACE2⁺小膽管細(xì)胞中，pIgR mRNA轉(zhuǎn)錄物和蛋白質(zhì)的水平明顯高于DUOX2^-ACE2^-膽管細(xì)胞和其他類型的肝細(xì)胞(圖6h-j)。另外，在對(duì)照組肝臟中，pIgR蛋白主要在DUOX2⁺ACE2⁺小膽管細(xì)胞中檢測(cè)到，而在PBC肝臟中，pIgR蛋白的表達(dá)明顯降低 (圖6k)。綜上所述，在人類PBC的致病過(guò)程中，pIgR特異性自身抗體可能與DUOX2⁺ACE2⁺小膽管細(xì)胞損傷有關(guān)。

圖6 pIgR主要在DUOX2⁺ACE2⁺小膽管細(xì)胞中表達(dá)，PBC患者血清中pIgR及其抗體水平明顯升高

 

 小結(jié)

該研究通過(guò)結(jié)合單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄測(cè)序、多重免疫熒光(IF)等的方法鑒定出肝臟中獨(dú)特的DUOX2⁺ACE2⁺小膽管細(xì)胞，并驗(yàn)證了其減少與PBC疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性。此外通過(guò)血清蛋白質(zhì)組學(xué)（4D-DIA）等方法證實(shí)了pIgR在DUOX2⁺ACE2⁺小膽管細(xì)胞中的高表達(dá)。該結(jié)果為PBC的早期致病過(guò)程提供了新的見解，并為PBC的診斷和治療干預(yù)提供了特定的生物標(biāo)志物。

 

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