單層細胞系傳代培養(yǎng)技術(shù)指南

大多數(shù)細胞系和原代細胞培養(yǎng)物生長為單一厚度的細胞層（單層）或附著在玻璃或經(jīng)過特殊處理的塑料基質(zhì)上的薄片。為了保持培養(yǎng)物的健康和積極生長，通常需要定期對它們進行傳代培養(yǎng)。

常見的傳代培養(yǎng)方法涉及通過使用蛋白水解酶（如胰蛋白酶或膠原酶）破壞細胞間和細胞與基質(zhì)的連接。在細胞解離成主要由單細胞組成的懸浮液后，將它們稀釋并轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)容器中。在那里它們可以重新附著并開始生長和分裂，經(jīng)過一段時間的孵化后再次接近匯合。此時，它們可以再次進行傳代培養(yǎng)或用于實驗。

以下指南描述了典型單層細胞培養(yǎng)的常規(guī)傳代和維護所涉及的基本原則。為了獲得一致的結(jié)果，保持良好的記錄很重要。記錄應(yīng)包括細胞傳代日期和傳代次數(shù)。

細胞周期性檢查

定期仔細檢查培養(yǎng)物以確定其狀態(tài)和健康狀況是一種很好的做法。用肉眼檢查培養(yǎng)容器中的內(nèi)容物，尋找微生物污染的宏觀證據(jù)，例如意外的 pH 值變化或培養(yǎng)基中的濁度和顆粒。還要尋找通過顯微鏡可能不容易看到的小真菌菌落。這些菌落可能漂浮在介質(zhì)-空氣界面上，尤其是在容器邊緣周圍。
其次，使用倒置顯微鏡檢查一般細胞形態(tài)和生長模式。仔細尋找微生物污染的任何微觀證據(jù)。在某些細胞系中，漂浮在培養(yǎng)基中的細胞是細胞死亡的標(biāo)志。然而，許多細胞在有絲分裂期間聚集，形成非常折射（明亮）的球體，如果培養(yǎng)物受到物理干擾，這些球體可能會自由漂浮。死細胞通常會聚集并分離，但通常不會折射。
除了這些日常檢查外，定期培養(yǎng)細胞進行真菌和細菌檢測，并檢測支原體污染情況。有幾種方法可用于檢查這些污染物。有關(guān)支原體檢測試劑盒和細胞培養(yǎng)試劑的信息，請參閱蘇州阿爾法生物實驗器材網(wǎng)站。

準備培養(yǎng)基

準備推薦用于細胞系的新鮮培養(yǎng)基，并適當(dāng)標(biāo)記培養(yǎng)容器。一定要添加補充劑并平衡 pH 值。在一個 75 cm 2 的燒瓶中，使用大約 12 至 15 mL 的培養(yǎng)基。相應(yīng)地調(diào)整其他培養(yǎng)容器的體積。

收獲細胞

大多數(shù)細胞培養(yǎng)物如果在達到匯合之前進行傳代培養(yǎng)（仍然有一些可用的生長空間），則生長最好。這將有助于使細胞保持在活躍的對數(shù)生長期。應(yīng)始終在為每個細胞系維護的記錄表上注明任何異常觀察結(jié)果。收集步驟旨在將細胞從其基質(zhì)中去除，并盡可能溫和地破壞細胞間的鍵合。對于大多數(shù)細胞培養(yǎng)，這需要在緩沖鹽水溶液中使用化學(xué)或酶解離劑。
胰蛋白酶 是常見的解離劑，通常以 0.05% 至 0.25% 的濃度使用。適宜工作濃度通常是通過使用min濃度的胰蛋白酶來確定的，該胰蛋白酶會在相對較短的時間內(nèi)（10 到 15 分鐘的孵育）從基質(zhì)中去除細胞并產(chǎn)生單細胞懸浮液。有些細胞比其他細胞更難分離，因此胰蛋白酶溶液經(jīng)常添加酶（如膠原酶）或螯合劑（如 EDTA）以改善結(jié)果。
在含有哺乳動物來源血清的培養(yǎng)基中生長的細胞需要洗滌以去除血清，因為胰蛋白酶會受到其存在的抑制。殘留血清通常是胰蛋白酶溶液無法將細胞與底物和彼此分離的原因。有多種緩沖鹽溶液可用。通常是基于Hanks 緩沖鹽水溶液、Earle 緩沖鹽溶液或 Dulbecco 磷酸鹽緩沖鹽溶液的改進。如果要將這些制劑用于解離細胞，通常會將這些制劑修改為不含鈣和鎂 (CMF-PBS)，因為這兩種離子在細胞與細胞和細胞與基質(zhì)的附著中起著重要作用。

收獲單層細胞的步驟 

1.取出并丟棄培養(yǎng)基。
2.用 5 mL 的解離溶液沖洗細胞片并取出。（本協(xié)議中使用的量適用于 75 cm 2燒瓶；對于其他容器中的培養(yǎng)物，按比例減少或增加量。）如果解離溶液含有胰蛋白酶，則去除所有痕量的血清非常重要，其中含有胰蛋白酶抑制劑。
3.添加 2 至 3 mL 的解離溶液。每 5 分鐘用倒置相差顯微鏡檢查一次酶處理的進度。特別難以分離的單分子層可置于 37°C 以促進分散。酶溶液的預(yù)熱也會縮短暴露時間。為避免結(jié)塊，在等待細胞分離時不要通過敲打或搖動燒瓶來攪動細胞。
4.使用移液器將 6 至 8 mL 生長培養(yǎng)基添加到細胞懸浮液中，并從培養(yǎng)容器底部清洗所有剩余的細胞。此時，倒置顯微鏡的快速檢查應(yīng)顯示細胞懸浮液由至少 95% 的單細胞組成。
5.如果不是這種情況，則可能需要更劇烈的移液。
6.收集細胞懸浮液，根據(jù)需要計數(shù)或分種接種物，然后分配到準備好的培養(yǎng)容器中。對于某些細胞系和酶溶液（膠原酶），有必要在分配（接種）細胞之前通過溫和離心（125 × g 5 分鐘）去除酶。

計數(shù)細胞或分裂懸液

 為了確定生長速率或建立已知濃度的培養(yǎng)物，有必要對懸浮細胞進行計數(shù)�？梢允褂醚�細胞計數(shù)器或電子細胞計數(shù)設(shè)備。血細胞計數(shù)器的優(yōu)點是價格較低，同時可以進行存活率測定。
 輕輕混合細胞懸浮液并取出 0.5 mL 等分試樣進行計數(shù)。向其中添加 0.5 mL 用于細胞計數(shù)的重要染色劑，例如臺盼藍或赤蘚紅 B�；旌暇鶆�，取出樣品，然后小心地裝入干凈的血細胞計數(shù)器。
 確定細胞懸浮液的實際濃度（細胞數(shù)/mL）和存活率百分比，并計算以適當(dāng)密度接種每個傳代培養(yǎng)物所需的懸浮液體積。懸浮液通常不計數(shù)細胞，而是分散在多個培養(yǎng)容器中。例如，1:2 拆分意味著將一個容器的細胞懸浮液分成兩個新容器，通常具有相同的表面積。這種方法適用于細胞系的日常維護，其中跟蹤準確的細胞密度并不重要。 

平板培養(yǎng)

將細胞懸浮液的適當(dāng)?shù)确衷嚇臃峙涞綔蕚浜玫娜萜髦校▽�濃縮細胞懸浮液添加到空培養(yǎng)容器中會導(dǎo)致細胞附著和生長不均勻）。生長較快的培養(yǎng)物通常在較低濃度下建立。除非最初添加min濃度的細胞，否則一些培養(yǎng)物不會生長良好。然而，大多數(shù)培養(yǎng)物在 10 3到 10 4 個細胞/cm 2或更高（7.5 × 10 4到 7.5 × 10 5個細胞/75-cm 2燒瓶）的初始濃度下會茁壯成長。 

重新培養(yǎng)培養(yǎng)物

將培養(yǎng)物放回振蕩培養(yǎng)箱中。大多數(shù)哺乳動物細胞培養(yǎng)物在 35°C 至 37°C 之間的穩(wěn)定溫度下表現(xiàn)較好。除了保持恒定溫度外，用于培養(yǎng)皿和多孔板等未密封培養(yǎng)物的培養(yǎng)箱還必須保持高濕度和二氧化碳水平。高濕度減少了未密封培養(yǎng)容器中的蒸發(fā)損失，這會導(dǎo)致培養(yǎng)基變得高滲并對細胞造成壓力。如果與含有適量碳酸氫鹽的緩沖系統(tǒng)一起使用，升高的二氧化碳水平（通常為 5% 至 10%）有助于維持適當(dāng)?shù)?pH 值（7.0 至 7.6）。

為了使這種類型的緩沖系統(tǒng)起作用，有必要使用未密封（松開的蓋子）或透氣的培養(yǎng)容器進行氣體交換。如果沒有CO 2 ，緩沖系統(tǒng)可以在密閉容器中保持適當(dāng)?shù)?pH 值。
第二天檢查培養(yǎng)物以確保細胞重新附著并活躍生長。根據(jù)需要更換介質(zhì)；對于大多數(shù)活躍生長的培養(yǎng)物來說，更換周期為約為每周 2 到 3 次。