細胞被支原體污染后的特征及支原體檢測試劑盒使用方法

很多小伙伴都疑惑，細胞被支原體污染后的特征是什么？如何鑒別細胞被支原體污染了？今天，我?guī)Т蠹曳窒韮蓚�支原體污染的案例，共同探尋一下細胞被支原體污染后的特征。
 

圖1 感染支原體的EBTr（牛胚氣管細胞）

先來觀察一下被支原體污染的牛胚氣管細胞（圖1），由成纖維樣逐漸變得類上皮樣；質(zhì)膜鋪展，潰爛；輪廓不清，邊界模糊。再看右圖，細胞處于邊增殖邊凋亡的狀態(tài)，漂浮凋亡細胞過多。

圖2 感染支原體的HT1080（人纖維肉瘤細胞）

接下來再觀察一下被支原體污染的人纖維肉瘤細胞HT1080（圖2），由上皮樣逐漸變得類成纖維樣，胞體細長，和前面的牛胚氣管細胞形態(tài)變化剛好相反；偽足伸長，出現(xiàn)明顯的拉絲現(xiàn)象，表明細胞可能在“痛苦”地遷移。使用了支原體殺除試劑，徹底根除了支原體以后，如右圖所示，細胞逐漸恢復了上皮樣形態(tài)，拉絲減少。

圖3 細胞膜上的支原體集落

接下來，給大家展示貼附在細胞膜上的支原體集落（圖3），支原體是目前已知最小的原核生物，直徑大小在0.1-0.3um，比細菌還要小。支原體可在培養(yǎng)液、細胞膜、細胞內(nèi)增殖。單個支原體需要借助于電鏡才可以觀察到具體形態(tài)，圖中膜上的黑點為支原體集落。細胞背景干凈，形態(tài)沒有大的變化，但質(zhì)膜粗糙，布滿黑點。
 

總結(jié)下來，細胞被支原體污染的主要特征如下：

✔ 增殖減慢；

✔ 上清液澄澈；

✔ 背景干凈；

✔ 細胞形態(tài)異常（拉絲、鋪展）；

✔ 更換新的培養(yǎng)液細胞狀態(tài)沒有恢復。

細胞被支原體污染后的共性表現(xiàn)為細胞增殖減慢、上清液澄澈、背景干凈，這3點可以明確地排除真、細菌污染。值得一提的是，當給細胞的營養(yǎng)體系不佳時，細胞也會表現(xiàn)出形態(tài)異常，所以，我們可以給細胞更換新的培養(yǎng)液，如果細胞也沒有恢復正常形態(tài)，此時判斷細胞極有可能被支原體“附身”了。
 

上述的判斷方法需要豐富的經(jīng)驗積累，日常細胞培養(yǎng)中，我們還可以用PCR擴增試劑盒檢測細胞是否有支原體污染。
 

支原體檢測試劑盒（PCR法）使用方法
 

1、樣品準備

取適量待檢細胞培養(yǎng)上清于潔凈的PCR管中（如果是血清樣本，可用 Mycoplasma Free Water 稀釋），利用PCR儀95℃熱處理5min后作為模板；
 

2、PCR體系配制

每次實驗需設置陰性對照（將1μL待檢樣品換成等量的Mycoplasma Free Water）與陽性對照（在1μL待檢樣品中加入0.5μL Positive Control后一起作為Template），實驗時戴一次性口罩與手套，謹慎操作，防止操作不當引入外源支原體污染；
 

3、PCR程序設置

表2

4、凝膠電泳

取10μL PCR產(chǎn)物，使用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測；
 

5、結(jié)果分析

每次實驗通過與陰性對照、陽性對照檢測結(jié)果比較確認樣品支原體污染情況，陽性條帶大小500bp左右。如陰性對照檢測結(jié)果中有條帶很有可能是PCR體系中出現(xiàn)污染，建議重新實驗確認結(jié)果。如有必要，也可對PCR產(chǎn)物進行常規(guī)測序，以確定具體的支原體種屬。