機械拉伸通過下調(diào)EZH2加重血管平滑肌細胞凋亡和血管重塑
血管平滑肌細胞（VSMCs）是構成血管壁組織結構及維持血管張力的主要細胞成分，受到垂直于血管的壓力，導致血管擴張以維持正常的血管穩(wěn)態(tài)。一些報告表明，病理性拉伸導致 VSMC 增殖、細胞死亡、表型轉換和遷移，導致血管重塑。然而，機械拉伸作用于平滑肌細胞的特定分子機制仍需要進一步探索。
EZH2是Polycomb基因家族的成員，Polycomb基因家族是一組重要的表觀遺傳調(diào)控基因，可抑制轉錄。EZH2是一種組蛋白甲基轉移酶，它通過催化組蛋白H3賴氨酸27（H3K27）的甲基化以控制各種基因表達，從而調(diào)節(jié)細胞的正常生理功能。許多研究發(fā)現(xiàn)，EZH2具有促癌的作用，抑制EZH2有可能提高某些癌癥的抗腫瘤免疫能力。近年來，EZH2因其在心血管疾病中的作用而受到越來越多的關注，因為研究結果對于指導靶向EZH2的抗腫瘤藥物在心血管疾病患者腫瘤中的應用具有重要意義。
研究表明，高幅度且均勻的流體剪切應力會降低內(nèi)皮細胞中EZH2的表達。濾泡間表皮干細胞的長期機械拉伸增加了體內(nèi)和體外的 EZH2 水平。EZH2在通過機械拉伸調(diào)節(jié)平滑肌細胞功能中的作用不太明確。
在山東省心血管疾病轉換醫(yī)學重點實驗室、山東大學齊魯醫(yī)院心血管內(nèi)科的一項研究中，探索了EZH2在機械拉伸下血管重塑發(fā)展中的作用，以及在小鼠體內(nèi)和體外人主動脈平滑肌細胞（HASMCs）中的潛在機制。
過度的機械拉伸會降低 VSMC s中 EZH2 的表達
如圖1 A、B所示，腹主動脈縮窄（AAC）小鼠胸主動脈培養(yǎng)基中EZH2的表達在1、2和3周時逐漸低于假手術對照組小鼠的表達。蛋白質(zhì)印跡分析表明，AAC小鼠EZH2的相對蛋白表達水平顯著降低（圖1 C）。在人VSMCs上進行進一步的體外實驗，以驗證EZH2響應機械拉伸的變化。使用循環(huán)拉伸加載系統(tǒng)，用機械拉伸（12%，1HZ）處理HASMCs，持續(xù)不同時間（0，6，12，24或48小時），結果表明，EZH2蛋白水平隨時間推移逐漸下降（圖1 D、E）。HASMCs在無拉伸或機械拉伸（12%）下處理24 h后，用機械拉伸（12%）處理的細胞中EZH2表達顯著降低（圖1 F-H）。
小鼠平滑�。⊿M）特異性過表達EZH2可改善血管重塑
為了探索平滑肌EZH2在體內(nèi)的作用，向小鼠注射了帶有EZH2的腺相關病毒（AAV-EZH2）或AAV-GFP作為對照2周。結果顯示，AAV-GFP在血管平滑肌細胞中表達。通過AAV-EZH2和AAV-GFP小鼠的WB檢測到血管組織中EZH2的表達。將AAV-EZH2和AAV-GFP小鼠隨機分為假手術組和AAC組，實驗共分為4組：對照組+假手術組、對照組+AAC組、AAV-EZH2+假手術組和AAV-EZH2+AAC組。通過免疫組織化學檢測血管組織中EZH2表達，表明AAV-EZH2上調(diào)AAC小鼠血管平滑肌細胞中EZH2表達。HE染色顯示，與對照+AAC組小鼠相比，AAC可顯著增加對照組小鼠胸主動脈中層厚度，而AAV-EZH2可顯著減少AAV-EZH2 +AAC小鼠主動脈中層厚度。
EZH2 有助于減少 AAC 后 VSMC 細胞凋亡
目前尚不清楚EZH2如何通過影響平滑肌細胞的功能來影響血管重塑。因此，實驗試圖確定EZH2過表達是否通過細胞凋亡減少了中膜平滑肌細胞的數(shù)量。結果發(fā)現(xiàn)，AAC后平滑肌細胞的凋亡顯著增加，但在EZH2過表達后顯著降低（圖2 A、B）。提取小鼠胸主動脈血管進行蛋白質(zhì)印跡，進一步確認了上述結果（圖2 C、D）。
EZH2 有助于減少機械拉伸下 VSMC 凋亡
EZH2在機械拉伸下對平滑肌細胞的影響的作用尚不清楚。使用循環(huán)拉伸加載系統(tǒng)，用不同幅度的機械拉伸（靜態(tài)，10%，12%，15%）處理HASMCs，EZH2蛋白水平隨著強度的增加而逐漸降低，細胞凋亡逐漸增加（圖3 A-C）。在12% 拉伸刺激24小時后分析細胞裂解物的凋亡指數(shù)（圖3 D、E）。實驗用EZH2腺病毒上調(diào)VSMCs中的EZH2蛋白表達。簡而言之，HASMCs轉染腺病毒（圖3 F）。用adv-EZH12轉染后用12%拉伸刺激HASMCs 24小時，然后檢測細胞凋亡。實驗表明，12% 拉伸顯著促進HASMC凋亡，EZH2過表達抑制HASMC凋亡（圖3 G-K）。
EZH2 不是通過增殖和表型轉換來改善血管重塑
目前尚不清楚EZH2是否通過影響平滑肌細胞凋亡以外的功能來改善血管重塑。免疫組化檢測血管組織中PCNA（細胞增殖核抗原）表達，結果顯示，AAC手術組上調(diào)PCNA在血管平滑肌細胞中的表達，而AAV-EZH2+AAC小鼠與AAC手術組差異無統(tǒng)計學意義。此外，機械拉伸下調(diào)平滑肌細胞中sm22α，α-SMA的表達，而EZH2的過表達不會逆轉這些影響。
機械拉伸通過 YAP-TEAD1 通路調(diào)控 EZH2
實驗證實了機械拉伸對EZH2的調(diào)節(jié)作用，但這種調(diào)節(jié)作用的機制仍有待闡明。先前的研究表明，生物力學拉伸誘導的YAP-TEAD通路的激活可以調(diào)節(jié)SMCs的功能。因此，實驗假設機械拉伸通過YAP-TEAD1通路調(diào)節(jié)EZH2。首先，發(fā)現(xiàn)機械拉伸通過降低YAP磷酸化來誘導YAP活性（圖4 A）。當使用TEAD1特異性小干擾RNA敲低TEAD1表達或小分子抑制劑維替泊芬（VP）在機械拉伸下破壞YAP-TEAD1相互作用時，發(fā)現(xiàn)EZH2的表達顯著升高（圖4 C、D）。
為了進一步驗證YAP-TEAD1對EZH2啟動子活性的調(diào)控作用，實驗生成了含有野生型（WT）結合區(qū)域的EZH2基因啟動子的熒光素酶報告基因，并進行了雙重熒光素酶測定。數(shù)據(jù)證實，YAP過表達顯著抑制WT啟動子熒光素酶活性（圖4 E）。為了進一步測試YAP-TEAD1是否可以通過預測的結合區(qū)域激活EZH2基因啟動子活性，實驗生成了含有野生型（WT）或突變型（MUT）結合區(qū)域的EZH2基因啟動子的熒光素酶報告基因，并進行了雙熒光素酶測定。數(shù)據(jù)顯示，與WT啟動子活性水平相比，MUT型啟動子活性水平顯著增強（圖4 F）。此外，TEAD1結合富集在EZH2基因的ATG密碼子上游的712 bp和815 bp之間（圖4 G、H）。此外，我們發(fā)現(xiàn)整合素β1在機械拉伸作用下升高，EZH2過表達后其表達降低。
過表達 EZH2 增強了 AAC 后 H3K27me3 的減少
在AAC小鼠胸主動脈中膜中檢測到H3K27me3的表達，與假手術對照小鼠相比，AAC小鼠在1、2和3周時其表達逐漸降低。然后，發(fā)現(xiàn)EZH2的過表達增強了AAC后H3K27me3的減少。為了探索GSK-J4（H3K27me3 抑制劑）是否與EZH2過表達病毒具有相同的效果，實驗共設置4組：對照+假組、對照+AAC組、GSK-J4+假組和GSK-J4+AAC組。對這4組血管的免疫熒光分析表明，GSK-J4可以顯著增強AAC引起的H3K27me3的降低。
GSK-J4 減少平滑肌細胞凋亡并改善血管重塑
為了研究GSK-J4是否也通過減少平滑肌細胞凋亡來改善血管重塑，實驗進行了HE染色。結果表明，與對照+AAC小鼠相比，AAC顯著增加了對照組小鼠胸主動脈中層厚度，而GSK-J4顯著降低了GSK-J4+AAC小鼠主動脈中層的增厚。此外，還檢測了GSK-J4小鼠的凋亡水平。TUNEL染色證明，AAC后平滑肌細胞凋亡顯著增加，GSK-J4處理后顯著降低。
目前的研究發(fā)現(xiàn)，EZH2是機械拉伸誘導的VSMC細胞凋亡的重要介質(zhì)。該實驗數(shù)據(jù)顯示，機械拉伸會降低體內(nèi)和體外EZH2的表達。在體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)SMCs中EZH2基因的過表達增加了H3K27me3的表達，從而減弱了AAC誘導的血管重塑。在體外，機械拉伸通過YAP-TEAD1通路下調(diào)EZH2并導致VSMC細胞凋亡增強。該研究是第一個報告機械拉伸對平滑肌細胞中EZH2表達的直接影響及其潛在機制的研究。
參考文獻：Zhong HY, Yuan C, Liu XL, Wang QQ, Li X, Zhao YC, Li X, Liu DD, Zheng TF, Zhang M. Mechanical stretch aggravates vascular smooth muscle cell apoptosis and vascular remodeling by downregulating EZH2. Int J Biochem Cell Biol. 2022 Oct;151:106278. doi: 10.1016/j.biocel.2022.106278. Epub 2022 Aug 17. PMID: 35985452.
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EZH2是Polycomb基因家族的成員，Polycomb基因家族是一組重要的表觀遺傳調(diào)控基因，可抑制轉錄。EZH2是一種組蛋白甲基轉移酶，它通過催化組蛋白H3賴氨酸27（H3K27）的甲基化以控制各種基因表達，從而調(diào)節(jié)細胞的正常生理功能。許多研究發(fā)現(xiàn)，EZH2具有促癌的作用，抑制EZH2有可能提高某些癌癥的抗腫瘤免疫能力。近年來，EZH2因其在心血管疾病中的作用而受到越來越多的關注，因為研究結果對于指導靶向EZH2的抗腫瘤藥物在心血管疾病患者腫瘤中的應用具有重要意義。
研究表明，高幅度且均勻的流體剪切應力會降低內(nèi)皮細胞中EZH2的表達。濾泡間表皮干細胞的長期機械拉伸增加了體內(nèi)和體外的 EZH2 水平。EZH2在通過機械拉伸調(diào)節(jié)平滑肌細胞功能中的作用不太明確。
在山東省心血管疾病轉換醫(yī)學重點實驗室、山東大學齊魯醫(yī)院心血管內(nèi)科的一項研究中，探索了EZH2在機械拉伸下血管重塑發(fā)展中的作用，以及在小鼠體內(nèi)和體外人主動脈平滑肌細胞（HASMCs）中的潛在機制。
過度的機械拉伸會降低 VSMC s中 EZH2 的表達
如圖1 A、B所示，腹主動脈縮窄（AAC）小鼠胸主動脈培養(yǎng)基中EZH2的表達在1、2和3周時逐漸低于假手術對照組小鼠的表達。蛋白質(zhì)印跡分析表明，AAC小鼠EZH2的相對蛋白表達水平顯著降低（圖1 C）。在人VSMCs上進行進一步的體外實驗，以驗證EZH2響應機械拉伸的變化。使用循環(huán)拉伸加載系統(tǒng)，用機械拉伸（12%，1HZ）處理HASMCs，持續(xù)不同時間（0，6，12，24或48小時），結果表明，EZH2蛋白水平隨時間推移逐漸下降（圖1 D、E）。HASMCs在無拉伸或機械拉伸（12%）下處理24 h后，用機械拉伸（12%）處理的細胞中EZH2表達顯著降低（圖1 F-H）。
圖1 AAC后VSMCs中EZH2在體內(nèi)和體外機械拉伸下表達降低。
小鼠平滑�。⊿M）特異性過表達EZH2可改善血管重塑
為了探索平滑肌EZH2在體內(nèi)的作用，向小鼠注射了帶有EZH2的腺相關病毒（AAV-EZH2）或AAV-GFP作為對照2周。結果顯示，AAV-GFP在血管平滑肌細胞中表達。通過AAV-EZH2和AAV-GFP小鼠的WB檢測到血管組織中EZH2的表達。將AAV-EZH2和AAV-GFP小鼠隨機分為假手術組和AAC組，實驗共分為4組：對照組+假手術組、對照組+AAC組、AAV-EZH2+假手術組和AAV-EZH2+AAC組。通過免疫組織化學檢測血管組織中EZH2表達，表明AAV-EZH2上調(diào)AAC小鼠血管平滑肌細胞中EZH2表達。HE染色顯示，與對照+AAC組小鼠相比，AAC可顯著增加對照組小鼠胸主動脈中層厚度，而AAV-EZH2可顯著減少AAV-EZH2 +AAC小鼠主動脈中層厚度。
EZH2 有助于減少 AAC 后 VSMC 細胞凋亡
目前尚不清楚EZH2如何通過影響平滑肌細胞的功能來影響血管重塑。因此，實驗試圖確定EZH2過表達是否通過細胞凋亡減少了中膜平滑肌細胞的數(shù)量。結果發(fā)現(xiàn)，AAC后平滑肌細胞的凋亡顯著增加，但在EZH2過表達后顯著降低（圖2 A、B）。提取小鼠胸主動脈血管進行蛋白質(zhì)印跡，進一步確認了上述結果（圖2 C、D）。
圖2 EZH2有助于AAC后VSMC凋亡的減少。
EZH2 有助于減少機械拉伸下 VSMC 凋亡
EZH2在機械拉伸下對平滑肌細胞的影響的作用尚不清楚。使用循環(huán)拉伸加載系統(tǒng)，用不同幅度的機械拉伸（靜態(tài)，10%，12%，15%）處理HASMCs，EZH2蛋白水平隨著強度的增加而逐漸降低，細胞凋亡逐漸增加（圖3 A-C）。在12% 拉伸刺激24小時后分析細胞裂解物的凋亡指數(shù)（圖3 D、E）。實驗用EZH2腺病毒上調(diào)VSMCs中的EZH2蛋白表達。簡而言之，HASMCs轉染腺病毒（圖3 F）。用adv-EZH12轉染后用12%拉伸刺激HASMCs 24小時，然后檢測細胞凋亡。實驗表明，12% 拉伸顯著促進HASMC凋亡，EZH2過表達抑制HASMC凋亡（圖3 G-K）。
圖3 EZH2有助于減少機械拉伸下的VSMC細胞凋亡。
EZH2 不是通過增殖和表型轉換來改善血管重塑
目前尚不清楚EZH2是否通過影響平滑肌細胞凋亡以外的功能來改善血管重塑。免疫組化檢測血管組織中PCNA（細胞增殖核抗原）表達，結果顯示，AAC手術組上調(diào)PCNA在血管平滑肌細胞中的表達，而AAV-EZH2+AAC小鼠與AAC手術組差異無統(tǒng)計學意義。此外，機械拉伸下調(diào)平滑肌細胞中sm22α，α-SMA的表達，而EZH2的過表達不會逆轉這些影響。
機械拉伸通過 YAP-TEAD1 通路調(diào)控 EZH2
實驗證實了機械拉伸對EZH2的調(diào)節(jié)作用，但這種調(diào)節(jié)作用的機制仍有待闡明。先前的研究表明，生物力學拉伸誘導的YAP-TEAD通路的激活可以調(diào)節(jié)SMCs的功能。因此，實驗假設機械拉伸通過YAP-TEAD1通路調(diào)節(jié)EZH2。首先，發(fā)現(xiàn)機械拉伸通過降低YAP磷酸化來誘導YAP活性（圖4 A）。當使用TEAD1特異性小干擾RNA敲低TEAD1表達或小分子抑制劑維替泊芬（VP）在機械拉伸下破壞YAP-TEAD1相互作用時，發(fā)現(xiàn)EZH2的表達顯著升高（圖4 C、D）。
為了進一步驗證YAP-TEAD1對EZH2啟動子活性的調(diào)控作用，實驗生成了含有野生型（WT）結合區(qū)域的EZH2基因啟動子的熒光素酶報告基因，并進行了雙重熒光素酶測定。數(shù)據(jù)證實，YAP過表達顯著抑制WT啟動子熒光素酶活性（圖4 E）。為了進一步測試YAP-TEAD1是否可以通過預測的結合區(qū)域激活EZH2基因啟動子活性，實驗生成了含有野生型（WT）或突變型（MUT）結合區(qū)域的EZH2基因啟動子的熒光素酶報告基因，并進行了雙熒光素酶測定。數(shù)據(jù)顯示，與WT啟動子活性水平相比，MUT型啟動子活性水平顯著增強（圖4 F）。此外，TEAD1結合富集在EZH2基因的ATG密碼子上游的712 bp和815 bp之間（圖4 G、H）。此外，我們發(fā)現(xiàn)整合素β1在機械拉伸作用下升高，EZH2過表達后其表達降低。
圖4 機械拉伸通過YAP-TEAD1通路調(diào)節(jié)EZH2。
過表達 EZH2 增強了 AAC 后 H3K27me3 的減少
在AAC小鼠胸主動脈中膜中檢測到H3K27me3的表達，與假手術對照小鼠相比，AAC小鼠在1、2和3周時其表達逐漸降低。然后，發(fā)現(xiàn)EZH2的過表達增強了AAC后H3K27me3的減少。為了探索GSK-J4（H3K27me3 抑制劑）是否與EZH2過表達病毒具有相同的效果，實驗共設置4組：對照+假組、對照+AAC組、GSK-J4+假組和GSK-J4+AAC組。對這4組血管的免疫熒光分析表明，GSK-J4可以顯著增強AAC引起的H3K27me3的降低。
GSK-J4 減少平滑肌細胞凋亡并改善血管重塑
為了研究GSK-J4是否也通過減少平滑肌細胞凋亡來改善血管重塑，實驗進行了HE染色。結果表明，與對照+AAC小鼠相比，AAC顯著增加了對照組小鼠胸主動脈中層厚度，而GSK-J4顯著降低了GSK-J4+AAC小鼠主動脈中層的增厚。此外，還檢測了GSK-J4小鼠的凋亡水平。TUNEL染色證明，AAC后平滑肌細胞凋亡顯著增加，GSK-J4處理后顯著降低。
圖5 病理機械拉伸通過降低EZH2的表達加重血管重塑。
目前的研究發(fā)現(xiàn)，EZH2是機械拉伸誘導的VSMC細胞凋亡的重要介質(zhì)。該實驗數(shù)據(jù)顯示，機械拉伸會降低體內(nèi)和體外EZH2的表達。在體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)SMCs中EZH2基因的過表達增加了H3K27me3的表達，從而減弱了AAC誘導的血管重塑。在體外，機械拉伸通過YAP-TEAD1通路下調(diào)EZH2并導致VSMC細胞凋亡增強。該研究是第一個報告機械拉伸對平滑肌細胞中EZH2表達的直接影響及其潛在機制的研究。
參考文獻：Zhong HY, Yuan C, Liu XL, Wang QQ, Li X, Zhao YC, Li X, Liu DD, Zheng TF, Zhang M. Mechanical stretch aggravates vascular smooth muscle cell apoptosis and vascular remodeling by downregulating EZH2. Int J Biochem Cell Biol. 2022 Oct;151:106278. doi: 10.1016/j.biocel.2022.106278. Epub 2022 Aug 17. PMID: 35985452.
小編旨在分享、學習、交流生物科學等領域的研究進展。如有侵權或引文不當請聯(lián)系小編修正。
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