慢病毒包裝常見問題匯總

 Q: 什么是MOI？
 
A: 在微生物學(xué)中， MOI是病原體(如噬菌體或病毒、細(xì)菌等)與感染目標(biāo)(如細(xì)胞)的比率。對(duì)于病毒， MOI是病毒顆粒數(shù)量與特定空間中存在的目標(biāo)細(xì)胞數(shù)量的比率。通常可將某株細(xì)胞有80%被感染時(shí)所用的病毒顆粒數(shù)和細(xì)胞數(shù)目的比值作為該株細(xì)胞的MOI。
 
  Q：如何稀釋病毒？     
                                                                           
A：您可使用完全培養(yǎng)基、PBS液等將病毒稀釋到需要的滴度。如將滴度為5 x 109 TU/ml的病毒稀釋到1 x109TU/ml，則需取20 µl病毒液加入到80 µl的完全培養(yǎng)基中。
 
  Q：用于病毒感染的細(xì)胞接種量是多少？       
                                                     
A: 根據(jù)細(xì)胞增殖的速度調(diào)整細(xì)胞接種量，以保證在感染后3天左右細(xì)胞剛好快長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿底部為宜。針對(duì)大部分細(xì)胞系： 傳代周期在2-3天，感染時(shí)細(xì)胞鋪板的密度保持在20-30%左右，則72h后細(xì)胞增殖后鋪板密度約在90%左右；針對(duì)某些原代細(xì)胞： 由于細(xì)胞增長(zhǎng)緩慢，可以在接種時(shí)提高匯合度到50%～ 60%，但要確保在感染后3天時(shí)細(xì)胞匯合度達(dá)到90%～ 100%；針對(duì)非分裂細(xì)胞： 如神經(jīng)元細(xì)胞，接種后不再增殖，此時(shí)可以按照80%的匯合度進(jìn)行接種。
 
  Q：如何提高病毒對(duì)細(xì)胞的感染效率？      
                                                        
A：病毒對(duì)細(xì)胞的感染效率受細(xì)胞自身生長(zhǎng)的狀態(tài)，細(xì)胞數(shù)量，細(xì)胞被病毒感染的難易程度等多個(gè)因素影響。因此保證細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，輪廓清晰，合適的細(xì)胞密度，選擇最優(yōu)的感染條件（如合適的MOI值）可以更好的保證感染效率。對(duì)于懸浮細(xì)胞，可采用離心感染方法，減少病毒感染時(shí)的體積，從而提高感染效率。如可以在加入病毒后將細(xì)胞培養(yǎng)板密封，用離心機(jī)在1000g條件下離心1h，再放回培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)。
 
  Q：加入病毒病毒后，細(xì)胞死亡很厲害，該如何處理？  
                                               
A：病毒有一定的細(xì)胞毒性，如果培養(yǎng)過程中細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的病變或細(xì)胞狀態(tài)變差，建議將轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)間縮短至5~8小時(shí)之間�；蛘哒{(diào)整并降低感染的MOI值，并且在感染后4小時(shí)、 8 小時(shí)、 12小時(shí)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行觀察，若發(fā)現(xiàn)細(xì)胞狀態(tài)變差時(shí)，則需要立刻對(duì)細(xì)胞進(jìn)行換液操作，使用新鮮的完全培養(yǎng)液替換病毒感染培養(yǎng)液
 
  Q：細(xì)胞能被病毒感染，但為何GFP熒光很弱？
                                                    
A：GFP病毒感染細(xì)胞后，細(xì)胞中熒光強(qiáng)度取決于病毒進(jìn)入到細(xì)胞的顆粒數(shù)、細(xì)胞本身的增殖狀態(tài)、細(xì)胞類等因素。在增殖較慢的細(xì)胞中感染病毒后， GFP蛋白表達(dá)達(dá)到峰值需要較長(zhǎng)的時(shí)間。 
 
  Q：腺病毒載體在體外實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意哪些問題？    
                                                  
A：由于細(xì)胞表面受體的差異，腺病毒載體在不同的細(xì)胞中轉(zhuǎn)導(dǎo)效率不同，可以通過預(yù)實(shí)驗(yàn)來判斷目的細(xì)胞中的腺病毒用量。病毒感染細(xì)胞的最佳時(shí)期是細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，因此，在細(xì)胞消化后12～24小時(shí)加入病毒。病毒感染時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)液的體積盡量小一些，以完全覆蓋細(xì)胞為準(zhǔn)。一般感染腺病毒24 小時(shí)后就能檢測(cè)到目的基因的表達(dá)，48 小時(shí)表達(dá)達(dá)到較高水平。
 
  Q：如何確定我所用的目的細(xì)胞是否可以被腺病毒感染？ 
 
A：腺病毒有廣泛的宿主范圍,它可以感染人類或者其他哺乳動(dòng)物細(xì)胞系或原代細(xì)胞，包括可分裂的和不可分裂的細(xì)胞。只有少數(shù)細(xì)胞系不被感染，例如一些淋巴細(xì)胞系對(duì)腺病毒有更強(qiáng)的抵抗性。為了確認(rèn)所使用的目的細(xì)胞是否能夠被腺病毒感染，需要通過帶有標(biāo)記（如GFP）的腺病毒對(duì)目的細(xì)胞進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。
 
蘇州阿爾法生物攜手海星提供的服務(wù)如下：
|   慢病毒包裝服務(wù)：
我們可以提供研究所需敲除質(zhì)粒載體構(gòu)建和慢病毒包裝服務(wù)。我們的慢病毒載體來源于HIV-1病毒，序列經(jīng)過精心優(yōu)化，提高了生物安全性、基因表達(dá)水平和病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。慢病毒可將特定基因片段隨機(jī)、穩(wěn)定地整合到宿主細(xì)胞的基因組中，實(shí)現(xiàn)目的基因的持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá)目的產(chǎn)物，因此，目前慢病毒載體已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于基因的表達(dá)調(diào)控如過表達(dá)，干擾和基因敲除。
 
 
|   腺病毒（AV）包裝服務(wù)：
腺病毒載體（Adenovirus）能夠攜帶大片段外源DNA、感染分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞、誘導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答（這對(duì)于疫苗開發(fā)是有益的）、表現(xiàn)出高效率的轉(zhuǎn)導(dǎo)和高水平的轉(zhuǎn)基因表達(dá)、不整合細(xì)胞DNA（在細(xì)胞內(nèi)保持dsDNA游離體）。
我們提供第一代腺病毒（E1/E3-deleted Ad5）和嵌合型腺病毒（Chimeric adenovirus）包裝服務(wù)。Ad5病毒的感染是通過病毒顆粒表面的纖突（Fiber）與細(xì)胞表面受體CAR（Coxsackie virus and adenovirus receptor）特異性結(jié)合而介導(dǎo)的。 并不是所有細(xì)胞都高表達(dá)CAR，Ad5病毒在某些不表達(dá)或者低表達(dá)CAR的細(xì)胞種類上的應(yīng)用受限。我們開發(fā)了嵌合型腺病毒，它的感染是通過嵌合型纖突（Chimeric fiber）與細(xì)胞表面分子CD46特異性結(jié)合而介導(dǎo)的。
 
|  腺相關(guān)病毒（AAV）包裝服務(wù)：
腺相關(guān)病毒(AAV)是一種人細(xì)小病毒，目前因?yàn)槟茏鳛橐环N基因治療載體而受到廣泛關(guān)注。腺相關(guān)病毒主要以游離于染色體的附加形式存在，并可長(zhǎng)期存在于非分裂期的細(xì)胞中。由于具有高組織特異性、低免疫原性、良好的擴(kuò)散性、高安全性以及宿主范圍廣等特點(diǎn)，AAV特別適用于體內(nèi)的研究，且已成為基因治療領(lǐng)域中最具前景的病毒載體之一。我們開發(fā)出一系列專有技術(shù)和試劑，從病毒滴度、純度、活性以及一致性等方面顯著提升了腺相關(guān)病毒包裝工藝水平。