活體光透明技術(shù)在活體神經(jīng)血管成像中的應(yīng)用

生物體是由復(fù)雜多樣的細(xì)胞構(gòu)成的，其結(jié)構(gòu)與功能通常是作為一個(gè)整體表現(xiàn)出來(lái)的。在器官乃至全身水平上，高分辨地獲取生物組織三維結(jié)構(gòu)信息對(duì)諸多生物醫(yī)學(xué)相關(guān)的研究至關(guān)重要，例如神經(jīng)科學(xué)中大腦神經(jīng)元連接信息的繪制、發(fā)育生物學(xué)中器官的形態(tài)發(fā)生等。

近年來(lái)興起的組織光透明技術(shù)是利用化學(xué)或物理的原理與方法將大塊組織或完整器官甚至活體動(dòng)物透明化處理的技術(shù)，通過(guò)采用多種物理、化學(xué)的手段，減小組織對(duì)光的衰減，使得生物組織變得對(duì)光“透明”，從而提高了光學(xué)成像的成像深度與成像質(zhì)量。該方法與多種熒光標(biāo)記技術(shù)、光學(xué)成像技術(shù)的結(jié)合為高分辨獲取組織器官的三維整體結(jié)構(gòu)信息提供了重要的手段，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)機(jī)械切片顯微成像技術(shù)的不足，在生命科學(xué)特別是神神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域產(chǎn)生了巨大的影響，作為新興起來(lái)的一種生物組織學(xué)技術(shù)，受到了越來(lái)越多科研人員的關(guān)注與青睞。                                                                                                      

最早見(jiàn)諸報(bào)道的組織光透明技術(shù)是德國(guó)科學(xué)家Werner Spalteholz用苯甲醇和水楊酸甲酯混合物“清除”心臟等大型器官。而最早嘗試腦組織光透明的方法，可以追溯到2007年維也納科技大學(xué)和德國(guó)馬普研究所的研究者首次使用苯甲醇和苯甲酸芐酯的混合物（BABB）透明小鼠全腦，并繪制出3D小鼠腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。在此之后組織光透明技術(shù)迅猛發(fā)展，到如今已經(jīng)有幾十種組織光透明相關(guān)技術(shù)。

圖2：不同離體組織透明方法發(fā)展歷史

正常的生物組織中成分復(fù)雜，如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和血紅素等物質(zhì)對(duì)光的傳播造成阻礙。光透明技術(shù)使用一種試劑或幾種試劑組成的混合液通過(guò)浸泡、電泳或灌注等處理方式,使大塊組織或完整器官達(dá)到視覺(jué)下透明或光學(xué)儀器下可見(jiàn)的效果，簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)就是讓這些生物組織具有光學(xué)透明特性，利用這種技術(shù)實(shí)現(xiàn)透明的腦標(biāo)本稱(chēng)為透明腦。Dodt等人在2007年首先完成了對(duì)出生后10天幼鼠全腦的透明，并命名為Murray透明法或BABB。Murray透明法的出現(xiàn)使得完整觀(guān)察神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)成為可能，并帶動(dòng)了現(xiàn)代組織透明技術(shù)的發(fā)展。這種技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于不破壞組織完整性的同時(shí)具有三維成像的能力。在此基礎(chǔ)上，組織透明技術(shù)經(jīng)諸多科研機(jī)構(gòu)努力涌現(xiàn)出了多種具體方法,并不斷完善和持續(xù)更新;最早實(shí)現(xiàn)透明的器官是腦，逐漸拓展至脊髓及其他器官;組織透明適用的物種也由起初的小鼠，逐漸擴(kuò)展到大鼠、兔、非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物乃至人類(lèi)。

圖3：大小鼠不同離體組織器官透明前后圖

完整的器官之所以不透明與其組成物質(zhì)有關(guān)，組織中含有水、蛋白質(zhì)、脂類(lèi)等多種不同物質(zhì)，各物質(zhì)折光系數(shù)不盡相同,當(dāng)光線(xiàn)通過(guò)這些不同組分時(shí)發(fā)生散射，并且組織或完整器官越厚散射越強(qiáng)透射越少，從而導(dǎo)致光學(xué)觀(guān)察受到了限制�；�于這一理論，現(xiàn)有的光透明技術(shù)的原理大致可分為兩類(lèi)：一類(lèi)是去除折光系數(shù)差異較大的物質(zhì),選擇性的去除組織器官中的某些物質(zhì)可以減少折光系數(shù)間的差異。鑒于蛋白質(zhì)是絕大多數(shù)生物醫(yī)學(xué)研究的目標(biāo)分子，所以需要使用脫水或脫脂的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)組織透明，而且脫水或脫脂越徹底，組織透明效果越好。第二類(lèi)主要是使用與組織折光系數(shù)相似的介質(zhì)溶液利用浸泡或灌注的方式使組織器官透明。事實(shí)上隨著光透明技術(shù)的不斷發(fā)展，幾乎沒(méi)有一種透明方法單純的使用一種透明原理，而是綜合多種原理來(lái)實(shí)現(xiàn)組織透明。

圖4：組織光透明原理

由于研究的需要，許多時(shí)候需要在研究生物體存活時(shí)觀(guān)察并監(jiān)測(cè)體內(nèi)活動(dòng)，如在活體動(dòng)物觀(guān)察腦血管或腦神經(jīng)。目前腦血管或腦神經(jīng)的在體觀(guān)察主要通過(guò)光學(xué)顯微鏡，此類(lèi)光學(xué)儀器在要求分辨率的情況下無(wú)法實(shí)現(xiàn)較深層成像，其成像對(duì)比度和深度都受到限制。因此將光透明技術(shù)引入到活體組織觀(guān)察腦血管或腦神經(jīng)，在解決成像對(duì)比度和深度這兩大關(guān)鍵問(wèn)題方面具極大潛力。佳維斯（武漢）生物醫(yī)藥有限公司核心技術(shù)團(tuán)隊(duì)將活體光透明技術(shù)引入到激光血流成像和雙光子顯微成像的相關(guān)研究課題中，根據(jù)長(zhǎng)期對(duì)該技術(shù)的研究和發(fā)展形成了活體顱骨光透明技術(shù)、活體皮膚光透明技術(shù)和活體硬組織光透明技術(shù)等活體光透明系列技術(shù)，可大大提高活體顱骨及皮膚成像深度與分辨率。

透明前顱骨和透明后顱骨對(duì)照

激光散斑血流成像技術(shù)能夠?qū)崟r(shí)直觀(guān)地觀(guān)察皮下血管結(jié)構(gòu)并評(píng)估其功能，不僅是了解正常的活體器官生理，而且對(duì)觀(guān)察各類(lèi)疾病中微血管功能障礙進(jìn)展與神經(jīng)退行性變之間的關(guān)系也至關(guān)重要。其原理為觀(guān)察目標(biāo)受到激光束照射時(shí)，反射后的激光形成隨機(jī)干擾圖像（包括亮區(qū)和暗區(qū)），該圖像稱(chēng)為激光散斑圖。如果被測(cè)目標(biāo)靜止，激光散斑圖也保持不變；如果被測(cè)物體發(fā)生移動(dòng)，例如組織中的紅細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，則激光散斑圖會(huì)隨之波動(dòng)。散斑變化速度以散斑對(duì)比度量化，而對(duì)比度與血流相關(guān)；這就是激光散斑血流成像技術(shù)用于血流流速變化和灌注量評(píng)估的工作原理。

就像所有的光學(xué)成像技術(shù)一樣，激光散斑血流成像技術(shù)也受限于成像深度，對(duì)皮膚表面的血管和血流能夠成像，再深層就很難進(jìn)行觀(guān)察。引入活體光透明系列技術(shù)，不但可以提升激光散斑血流成像深度，而且提升了分辨率，以下的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明活體光透明后激光散斑血流成像的結(jié)果更清晰，背景更為“清澈”。

(a)為小鼠耳朵圖像， (b)為透明化5min后耳朵圖像，(c)為10min后耳朵圖像                       

在很多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中都需要開(kāi)顱手術(shù)以進(jìn)行相關(guān)的實(shí)驗(yàn)，活體顱骨光透明后無(wú)需開(kāi)顱即可進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)。目前完整顱骨是觀(guān)察小鼠大腦皮下神經(jīng)和血管的主要障礙，為了克服這一障礙，科研工作者們開(kāi)發(fā)出幾種類(lèi)型的顱窗，包括磨薄顱窗、開(kāi)顱手術(shù)和磨薄加固顱窗等。這些顱窗在某些情況下滿(mǎn)足研究要求，但有局限性。例如，在顱骨窗變薄的情況下，很難進(jìn)行大面積重復(fù)成像；開(kāi)顱手術(shù)幾乎不可避免地會(huì)導(dǎo)致皮質(zhì)損傷和炎癥；至于磨薄加固顱窗操作復(fù)雜且也會(huì)造成損傷。而活體組織光透明的應(yīng)用解決了這些問(wèn)題。通過(guò)在顱骨上進(jìn)行組織光透明，可直接觀(guān)測(cè)小鼠大腦皮下血管，不用對(duì)顱骨造成損傷。

圖8：顱骨透明前無(wú)法觀(guān)察到任何血管，顱骨透明15min后，肉眼可見(jiàn)大量皮質(zhì)血管。在PBS清洗干燥后，頭骨再次回復(fù)最初狀態(tài)。再反復(fù)透明處理，還能觀(guān)察到血管。最后在同一區(qū)域建立光學(xué)顱窗，與透明后效果類(lèi)似。觀(guān)察到的皮質(zhì)血 管結(jié)構(gòu)與通過(guò)光學(xué)透明顱窗觀(guān)察到的相同，兩種情況下都能清楚地區(qū)分大血管和微血管。

如同激光散斑成像碰到“小鼠顱骨”的問(wèn)題一樣，在皮質(zhì)上小鼠顱骨也阻礙了熒光標(biāo)記的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和微血管的觀(guān)察。同樣，活體顱骨光透明技術(shù)也能輔助雙光子顯微鏡進(jìn)行更深層成像，無(wú)需顱窗手術(shù)“越過(guò)”顱骨成像觀(guān)察大腦皮層結(jié)構(gòu)。

根據(jù)以上結(jié)果可以明顯發(fā)現(xiàn)，活體光透明處理后雙光子成像的信號(hào)強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，且成像深度也大大提高。這些結(jié)果表明，光透明處理顱骨不僅提高了雙光子顯微鏡的成像分辨率和對(duì)比度，而且還大幅提升了成像深度。

活體顱骨光透明技術(shù)操作簡(jiǎn)單、安全有效，結(jié)合雙光子顯微鏡或激光血流成像儀，能夠反復(fù)觀(guān)察腦皮層的微血管、神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞等。與現(xiàn)有的顱窗手術(shù)技術(shù)相比，無(wú)需對(duì)顱骨進(jìn)行磨薄或移除，從而不會(huì)造成損傷。這種方法也被證明是安全的，幾乎不會(huì)造成意外損傷或感染。由于不會(huì)造成炎癥，此技術(shù)也更適合對(duì)微環(huán)境高度敏感的免疫細(xì)胞（膠質(zhì)細(xì)胞）進(jìn)行研究。因此，活體顱骨光透明技術(shù)無(wú)需對(duì)顱骨進(jìn)行磨薄或切除，可以在大腦正常狀態(tài)下觀(guān)察皮層神經(jīng)和血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)與功能，且可以長(zhǎng)期可逆透明成像觀(guān)測(cè)。

活體光透明技術(shù)作為一種新興的活體成像樣本制備技術(shù)，具有革命性的意義。在維持活體器官活性和完整性的同時(shí)具有光透明特征，不但廣泛應(yīng)用于活體激光血流成像的相關(guān)研究，在輔助雙光子觀(guān)察神經(jīng)元和血管的應(yīng)用方面及近紅外成像等方面也具有廣闊前景，可大大提高這些活體光學(xué)檢測(cè)設(shè)備成像深度和分辨率。