naica微滴芯片數字PCR在準確檢測精細胞中tRFs差異表達的應用
導讀
除了在蛋白質翻譯中的作用外，tRNA可以被切割成較短的生物活性片段，稱為tRNA片段（tRFs）。來自精細胞的特定tRFs可以引起第二代小鼠中代謝紊亂。因此，種系細胞中的tRFs是表觀遺傳的一種機制，然而壓力和毒素會導致tRFs模式的改變。華盛頓大學婦產科臨床研究部的研究人員在MOLECULAR HUMAN REPRODUCTION上發(fā)表題為《Men who inject opioids exhibit altered tRNA-Gly-GCC isoforms in semen》的文章。本研究對注射阿片類藥物（一個重要的壓力源）是否會影響生殖細胞中的tRFs感興趣。研究者對來自注射阿片類藥物病人(PWID)和非藥物使用對照組精液來源外泌體及精母細胞進行了RNA測序。測序后采用naica®微滴芯片數字PCR技術驗證數據，該技術的應用為藥物濫用相關生育問題的研究提供了新的策略和方法。
阿片類藥物濫用對生殖系統(tǒng)的影響一直備受關注。近期一項研究揭示了注射阿片類藥物的男性精液中tRNA-Gly-GCC外泌體的變化。該研究通過數字PCR技術檢測tRNA-Gly-GCC外泌體，發(fā)現未注射阿片類藥物的男性與注射阿片類藥物的男性精液中tRNA-Gly-GCC外泌體存在顯著差異。
tRNA-Gly-GCC外泌體在精子發(fā)生和成熟過程中扮演關鍵角色。研究結果表明，這些差異可能與精子質量和生育能力的下降有關。naica®微滴芯片數字PCR技術在本研究中的應用，不僅提供了高靈敏度和高準確性的檢測方法，對揭示阿片類藥物對生殖系統(tǒng)的影響具有重要意義。
應用亮點：
▶ naica®微滴芯片數字PCR技術可以在RNA濃度低于檢測下限的樣品中檢測兩種tRFs形式。
▶ naica®微滴芯片數字PCR結果與RNA測序結果具有很好的相關性，但比測序具有更高的靈敏度和準確性，有助于深入了解長期使用阿片類藥物的生物學影響。
研究結果：
▲圖１.男性長期使用阿片類藥物導致精子中tRF-Gly亞型比例的變化,使用naica®微滴芯片數字PCR技術定量tRFs。成熟精子細胞通過45-90% Percoll梯度純化，并使用核苷素試劑盒分離小RNA。cDNA使用一種特定的莖環(huán)RT引物與“長”tsRNA亞型（53個核苷酸長）或另一種靶向“短”tsRNA變體（32個核苷酸長）的特定RT引物生成。（A）每微升cDNA中“長”tRF Gly-GCC亞型的濃度。（B）每微升cDNA中“短”tRF Gly-GCC亞型的濃度。（C）“長”與“短”tRF Gly-GCC亞型的比例。（D）每微升cDNA中miR100-5p的濃度。“C”：對照組（不注射藥品的男性）;“PWID”：阿片藥物注射組。P值通過單尾曼-惠特尼U檢驗計算。對照組：n=10，PWID組：n=13。
研究發(fā)現，對照組中超過90%的reads到較短的Gly-GCC tRF，而在PWID中只有45%的讀數。相比之下，對照組中只有4.1%的reads到更長的tRF，而PWID為45.6%。PWID的長/短tRF比顯著高于對照組。同時發(fā)現精液來源的外泌體中小核仁RNA（snoRNA）表達差異。盡管無法確立PWID的發(fā)現與阿片類藥物使用之間的直接聯(lián)系，但研究表明阿片類藥物注射和/或相關多藥使用習慣和生活方式改變可能會影響表觀遺傳。這為阿片類藥物使用的可遺傳影響提供了證據，并為進一步研究其跨代健康影響的機制奠定了基礎。
數字PCR技術在研究PWID中差異表達的tRFs方面發(fā)揮了重要作用。由于精液中含有復雜的細胞混合物，意味著其中含有抑制劑，對于PCR的擴增有很大影響。但數字PCR有抗抑制劑干擾的特點，所以對于這類復雜樣本的檢測更為適用。文章中數字PCR和測序各自發(fā)揮了作用：測序用于發(fā)現長tRF和短tRF，而數字PCR則準確檢測了tRF片段的表達差異，進而驗證了測序的結果。這一發(fā)現表明，數字PCR在研究tRFs和其他非編碼RNA片段方面具有顯著的優(yōu)勢。數字PCR不僅可以在tRFs和其他類似的研究中提供更為精確的結果，還可以在諸如癌癥、遺傳學和傳染病等領域發(fā)揮關鍵作用。
原文鏈接如下：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC9976897/
naica®六通道數字PCR系統(tǒng)
法國Stilla Technologies公司naica®六通道數字PCR系統(tǒng)，源于Crystal微滴芯片式數字PCR技術，自動化微滴生成和擴增，每個樣本孔可實現6熒光通道的檢測，智能化識別微滴并進行質控，3小時內即可獲得至少6個靶標基因的絕對拷貝數濃度。
