單細(xì)胞及空間多組學(xué)揭示APOE4在衰老、神經(jīng)炎癥和阿爾茲海默癥的機制
代謝功能障礙和慢性神經(jīng)炎癥是包括多種神經(jīng)退行性疾病的共同特征。其中，晚發(fā)性 阿爾茲海默癥（AD）最強的遺傳風(fēng)險因素載脂蛋白 E（APOE） 的E4等位基因與代謝功能障礙和增強的促炎癥反應(yīng)有關(guān)。淀粉樣蛋白斑塊觸發(fā)附近小膠質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄變化，導(dǎo)致向病理特征轉(zhuǎn)變。這些重要的研究共同強調(diào)了APOE、衰老和大腦區(qū)域在代謝和免疫變化中的淀粉樣蛋白依賴性和獨立性作用。2023年3月，來自University of Kentucky研究團隊在 Cell Reports （IF 10.99）上發(fā)表題為“APOE modulates microglial immunometabolism in response to age, amyloid pathology, and inflammatory challenge”的研究文章。該研究結(jié)合單細(xì)胞和空間多組學(xué)技術(shù)，系統(tǒng)地描述APOE4在大腦對衰老、外周炎癥挑戰(zhàn)和淀粉樣蛋白病理學(xué)的反應(yīng)中的作用（有氧糖酵解增加和脂質(zhì)代謝途徑的表達(dá)改變），為后續(xù)的研究提供更加堅實的理論基礎(chǔ)。
樣本選擇：APOE3（野生型）、APOE4（突變型）和5XFAD（雜交模型）小鼠的大腦組織
取樣時間/分組：不同時間點（3、12 和 24 個月齡）、脂多糖處理 (LPS)和淀粉樣蛋白過表達(dá)的小鼠（n=3~5）
技術(shù)路線
步驟1：單細(xì)胞多組學(xué)揭示APOE4對阿爾茲海默癥的影響；
步驟2：單細(xì)胞多組學(xué)聯(lián)合揭示LPS刺激下的小膠質(zhì)細(xì)胞代謝特征；
步驟3：空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)揭示APOE4 加劇小膠質(zhì)細(xì)胞活化和脂質(zhì)代謝功能激活;
步驟4：空間代謝組證實APOE、衰老和淀粉樣蛋白對多種脂質(zhì)代謝途徑表達(dá)的顯著影響。
研究結(jié)果
1. 單細(xì)胞多組學(xué)揭示APOE4 驅(qū)動神經(jīng)膠質(zhì)轉(zhuǎn)錄組的免疫代謝變化
通過常規(guī)轉(zhuǎn)錄組檢測APOE對AD小鼠的整個生命周期的影響，在AOPE4和AOPE3大腦之間發(fā)現(xiàn)了數(shù)百個差異表達(dá)基因（DEG），包括Serpina3n等。接下來，進(jìn)一步對DEG進(jìn)行了通路分析，發(fā)現(xiàn)TOP 十富集的通路中有9個屬于代謝或免疫相關(guān)的途徑。為了確定細(xì)胞特異性對這些基因表達(dá)變化的貢獻(xiàn)，對大腦組織進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組檢測，結(jié)果共鑒定出了13種細(xì)胞類型。而通過對細(xì)胞群的DEG分析發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、室管膜細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞是受APOE影響最大的細(xì)胞類型。然后，對所有細(xì)胞的DEG進(jìn)行通路分析再次突出了代謝的重要作用，尤其是氧化磷酸化和糖酵解相關(guān)通路。這些結(jié)果表明APOE4主要驅(qū)動的是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的代謝和免疫反應(yīng)。
圖1 APOE4驅(qū)動神經(jīng)膠質(zhì)轉(zhuǎn)錄組的免疫代謝變化
2. 單細(xì)胞多組學(xué)揭示DAM樣小膠質(zhì)細(xì)胞在AOPE4老年腦中增加
淀粉樣斑塊觸發(fā)附近小膠質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄變化，并且誘導(dǎo)其向病理特征的轉(zhuǎn)變，這些發(fā)生病理特征轉(zhuǎn)變的小膠質(zhì)細(xì)胞被稱為疾病相關(guān)小膠質(zhì)細(xì)胞(DAMs)。通過對單細(xì)胞數(shù)據(jù)的進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)在高齡和AOPE4小鼠腦中都被上調(diào)的基因大量富集了DAM。此外，AOPE4小鼠中小膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組中的特異性變化與之前研究報道的結(jié)果相似。觀察到許多AD相關(guān)基因的表達(dá)模式相反，與E3相比，年輕的AOPE4小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)更高。通過對所有星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的亞群再聚類分析，發(fā)現(xiàn)一個小膠質(zhì)細(xì)胞的Mi_6亞群中APOE上調(diào)，其定義Mi_6亞群特征的marker基因幾乎完全是與DAM特征相關(guān)的基因，包括代謝基因Lpl、Ch25h、Fabp5和APOE本身。以及Mi_6小膠質(zhì)細(xì)胞的通路分析顯著表現(xiàn)在膽固醇代謝和糖酵解代謝相關(guān)的信號通路。進(jìn)一步的SCENIC分析發(fā)現(xiàn)了Mi_6亞群中16個特異性的轉(zhuǎn)錄因子。有趣的是，這些轉(zhuǎn)錄因子中有幾個先前的報道與AD有關(guān)。特別是HIF1α，在Mi_6中大幅上調(diào)，并與細(xì)胞的DAM評分呈正相關(guān)�？傊@些數(shù)據(jù)表明，即使沒有明顯的AD病理學(xué)，衰老和AOPE4也足以驅(qū)動小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生變化。
淀粉樣斑塊觸發(fā)附近小膠質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄變化，并且誘導(dǎo)其向病理特征的轉(zhuǎn)變，這些發(fā)生病理特征轉(zhuǎn)變的小膠質(zhì)細(xì)胞被稱為疾病相關(guān)小膠質(zhì)細(xì)胞(DAMs)。通過對單細(xì)胞數(shù)據(jù)的進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)在高齡和AOPE4小鼠腦中都被上調(diào)的基因大量富集了DAM。此外，AOPE4小鼠中小膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組中的特異性變化與之前研究報道的結(jié)果相似。觀察到許多AD相關(guān)基因的表達(dá)模式相反，與E3相比，年輕的AOPE4小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)更高。通過對所有星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的亞群再聚類分析，發(fā)現(xiàn)一個小膠質(zhì)細(xì)胞的Mi_6亞群中APOE上調(diào)，其定義Mi_6亞群特征的marker基因幾乎完全是與DAM特征相關(guān)的基因，包括代謝基因Lpl、Ch25h、Fabp5和APOE本身。以及Mi_6小膠質(zhì)細(xì)胞的通路分析顯著表現(xiàn)在膽固醇代謝和糖酵解代謝相關(guān)的信號通路。進(jìn)一步的SCENIC分析發(fā)現(xiàn)了Mi_6亞群中16個特異性的轉(zhuǎn)錄因子。有趣的是，這些轉(zhuǎn)錄因子中有幾個先前的報道與AD有關(guān)。特別是HIF1α，在Mi_6中大幅上調(diào)，并與細(xì)胞的DAM評分呈正相關(guān)�？傊@些數(shù)據(jù)表明，即使沒有明顯的AD病理學(xué)，衰老和AOPE4也足以驅(qū)動小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生變化。
圖2 衰老和 APOE4與DAM樣小膠質(zhì)細(xì)胞的增加有關(guān)
3. 單細(xì)胞多組學(xué)探究炎癥促進(jìn)APOE4小膠質(zhì)細(xì)胞的代謝功能激活
鑒于AOPE4小膠質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)出的代謝和DAM樣特征，接下來研究AOPE4的小膠質(zhì)細(xì)胞是否會對炎癥挑戰(zhàn)做出不同的反應(yīng)。通過外周注射LPS和生理鹽水，24 小時后，作者從AOPE3和AOPE4小鼠中收取大腦組織，分選后對小膠質(zhì)細(xì)胞群進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組檢測。在單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析的結(jié)果中顯示，LPS處理組中，小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生了幾個不同的亞群，包括兩個富含AOPE3 LPS大腦的亞群（5 和 7）和兩個幾乎完全存在于AOPE4 LPS大腦中的亞群（8 和11）。其中，富含AOPE4 LPS的亞群表達(dá)的DEG富集分析結(jié)果顯示與線粒體功能、有氧呼吸和能量產(chǎn)生功能相關(guān)。并且，這些細(xì)胞亞群還顯示出與氧化磷酸化和糖酵解途徑相關(guān)的基因高表達(dá)。以上的數(shù)據(jù)表明，AOPE4的小膠質(zhì)細(xì)胞中炎癥刺激下產(chǎn)生強烈的代謝應(yīng)激反應(yīng)。
圖3 APOE4小膠質(zhì)細(xì)胞在應(yīng)對炎癥挑戰(zhàn)時代謝不同
接下來，作者使用靶向代謝組學(xué)方法，確定了五種在 AOPE4小膠質(zhì)細(xì)胞中顯著上調(diào)的代謝物和一種顯著下調(diào)的代謝物。為了確定這些代謝物的差異是否是 AOPE4小膠質(zhì)細(xì)胞代謝動態(tài)變化的一部分，接下來使用穩(wěn)定同位素分辨代謝組學(xué)技術(shù)。在存在13C葡萄糖的情況下，用 IFNg和TNF-α的組合刺激AOPE3和AOPE4小膠質(zhì)細(xì)胞，并測量下游代謝物中13C 的摻入。結(jié)果表明，在APOE4和促炎環(huán)境中，標(biāo)記的(m+3) 13C乳酸顯著增加，表明通過有氧糖酵解途徑增強。為了進(jìn)一步從功能上評估APOE對小膠質(zhì)細(xì)胞代謝的影響，使用Seahorse平臺來測量糖酵解、線粒體呼吸等多個途徑對 ATP產(chǎn)生的相對貢獻(xiàn)。AOPE4小膠質(zhì)細(xì)胞主要是通過增加糖酵解生成ATP來響應(yīng)促炎刺激。另外，HIF1α TF復(fù)合物易位至細(xì)胞核并激活許多對增加糖酵解很重要的基因，HIF1α的這種表現(xiàn)與AOPE4模型小膠質(zhì)細(xì)胞的表型一致。接下來，作者對這些分析結(jié)果數(shù)據(jù)通過RT-PCR進(jìn)行了驗證。綜上所述，這些數(shù)據(jù)共同突出了功能性代謝重編程，AOPE4小膠質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)的是經(jīng)典活化的巨噬細(xì)胞的表型，具有促糖酵解和抗氧化的作用。
圖4 AOPE4 小膠質(zhì)細(xì)胞增加了有氧糖酵解和更高的 Hif1a 表達(dá)
4. 空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究顯示APOE4加劇小膠質(zhì)細(xì)胞的活化和脂質(zhì)代謝
接下來，利用10x visium空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)研究了AOPE3、AOPE4以及與5XFAD雜交的小鼠在年輕和年老時冠狀腦切片的表達(dá)情況。對這些數(shù)據(jù)進(jìn)行分析共鑒定出了18個clusters，并且發(fā)現(xiàn)只有一個cluster（cluster11）特異性存在于AOPE4/5XFAD雜交小鼠的大腦皮質(zhì)區(qū)。通過進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，這一特殊的cluster顯著富集脂質(zhì)代謝、突觸修剪、神經(jīng)元死亡以及小膠質(zhì)細(xì)胞激活相關(guān)的基因。將這些數(shù)據(jù)與單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序的數(shù)據(jù)進(jìn)行聯(lián)合分析，結(jié)果表明，這一特征僅在小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，尤其是Mi_6亞群的表達(dá)尤為顯著。為了確定這種獨特的AOPE4/5XFAD轉(zhuǎn)錄譜是否在空間上與AD病理相關(guān)，我們對空間轉(zhuǎn)錄組相鄰10μm的位置取了切片用于染色，充分驗證了空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析的結(jié)果。然后，作者基WGCNA分析突出顯示了斑塊強度與包含與離子通道和突觸傳遞相關(guān)的基因的兩個基因網(wǎng)絡(luò)呈負(fù)相關(guān)。然后將結(jié)果映射到單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)上，作者發(fā)現(xiàn)了一個被稱為 “小膠質(zhì)細(xì)胞激活模塊”的洋紅色調(diào)控網(wǎng)絡(luò)被映射到小膠質(zhì)細(xì)胞上，而紅色的“脂質(zhì)、少突膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性”模塊主要映射到少突膠質(zhì)細(xì)胞。有趣的是，紅色和洋紅色模塊在APOE4/5XFAD小鼠進(jìn)行的空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中確定的少突膠質(zhì)細(xì)胞基因（OLIG）和plaque-induced gene (PIG) 網(wǎng)絡(luò)實質(zhì)上重疊。并且PIG 評分在年輕大腦中最低，隨著年齡的增長略有增加，在APOE4/5XFAD大腦中最高，而OLIG評分遵循相反的趨勢�？傊�，這些數(shù)據(jù)突出了APOE4小膠質(zhì)細(xì)胞活化增強以及脂蛋白和脂質(zhì)代謝的改變。
圖5 APOE4加劇小膠質(zhì)細(xì)胞活化和脂質(zhì)代謝的改變
5. 空間代謝組學(xué)證實APOE、衰老和淀粉樣蛋白對多種脂質(zhì)代謝途徑表達(dá)的顯著影響
在上述的腦組織空間轉(zhuǎn)錄組研究中，作者注意到 APOE、衰老及其相互作用對多種脂質(zhì)代謝途徑有顯著影響。為了驗證涉及脂質(zhì)失調(diào)的特征，作者通過空間代謝組學(xué)技術(shù)（MALDI-MSI）來對目標(biāo)脂質(zhì)種類進(jìn)行空間分辨的定性和定量檢測，并且只在APOE4/5XFAD小鼠腦中發(fā)現(xiàn)與疾病相關(guān)的病理區(qū)域。與其他組相比，APOE4/5XFAD腦組織中多種脂質(zhì)種類的含量發(fā)生了變化，包括多種磷脂酰膽堿（PC）。APOE4/5XFAD大腦中磷脂酰膽堿增加最多的PC(16:0/18:2)在皮質(zhì)、海馬體和丘腦中顯示出巨大變化，但在梨狀區(qū)、皮質(zhì)底板和下丘腦中沒有差異。綜上所述，這些結(jié)果表明，APOE4/5XFAD腦脂質(zhì)代謝失調(diào)的轉(zhuǎn)錄特征通過多種脂質(zhì)(特別是PC)的改變得到了驗證。
圖6 多種脂質(zhì)種類的區(qū)域特異性變化
小編小結(jié)
在這篇研究中，作者著手時下熱點技術(shù)，采用單細(xì)胞和空間多組學(xué)方法系統(tǒng)地研究 APOE基因型對衰老、炎癥挑戰(zhàn)和淀粉樣蛋白反應(yīng)的影響。首先，應(yīng)用單細(xì)胞多組學(xué)技術(shù)揭示了小膠質(zhì)細(xì)胞(Mi_6)亞群在APOE4和衰老的AD模型組中的重要作用，詳細(xì)的描述了APOE4小膠質(zhì)細(xì)胞通過糖酵解等調(diào)控途徑促進(jìn)炎癥，從而形成有利于慢性神經(jīng)炎癥的情況。其次，作者基于空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)揭示了APOE4腦中看到的PIGhigh/OLIGlow可能導(dǎo)致補體激活，突觸修剪異常以及軸突髓鞘形成失衡，從而進(jìn)入惡性循環(huán)，傳播神經(jīng)炎癥和脂質(zhì)循環(huán)受損。最后，作者利用空間代謝組學(xué)技術(shù)還發(fā)現(xiàn)了在APOE4中存在一個與脂質(zhì)代謝相關(guān)的特征區(qū)域�？偟膩碚f，通過單細(xì)胞和空間多組學(xué)技術(shù)揭示了APOE4通過以代謝途徑為中心使易感腦區(qū)更易發(fā)生神經(jīng)變性的調(diào)控機制，并提出了結(jié)合代謝和炎癥的治療方法可能在治療和預(yù)防AD方面具有極大的應(yīng)用前景。
中科優(yōu)品推薦
【中科新生命】重點布局時空多組學(xué)平臺，先后建立了基于10x Genomics Chromium X的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序平臺和visium空間轉(zhuǎn)錄組平臺。以及基于Bruker MALDI 2 Tims-tof flex空間代謝組平臺開發(fā)的一站式高端版的空間代謝組學(xué)分析解決方案，通過增加分子分離維度和對“后電離”技術(shù)的創(chuàng)新應(yīng)用，實現(xiàn)對代謝物進(jìn)行空間分布分析的同時完成高深度的定性定量。中科新生命作為國內(nèi)首家引入MALDI 2Tims-tof flex平臺的服務(wù)商， 能夠給廣大科研工作者提供相比傳統(tǒng)空間代謝組更多維、更靈敏的代謝檢測服務(wù)。
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