P4SPR應(yīng)用案例：跨膜蛋白質(zhì)(TM)的作用機(jī)制研究

圖一  果蠅觸角與纖毛放大示意圖
 

盡管這些蛋白質(zhì)具有重要作用，其功能上的精確機(jī)制尚未得到很好的理解。在文獻(xiàn)里許多基于體外生化測(cè)定的研究發(fā)現(xiàn)，這些蛋白質(zhì)有大量的配體和配體結(jié)合區(qū)域。在其他研究中,有證據(jù)表明配體/CD36 蛋白相互作用可能參與調(diào)節(jié)配體在膜上的易位和受體介導(dǎo)的配體內(nèi)化。然而，這些未被發(fā)現(xiàn)的 CD36 蛋白生化特性的相關(guān)性尚未在其原生環(huán)境中得到廣泛驗(yàn)證。

一個(gè)特別受關(guān)注的遺傳學(xué)模型地中海黑腹果蠅已知有14個(gè)CD36樣的蛋白質(zhì)，因此提供了一個(gè)有用的系統(tǒng)來(lái)研究CD36 蛋白質(zhì)在體內(nèi)的功能。其中一個(gè)果蠅 CD36 家族成員稱(chēng)為感覺(jué)神經(jīng)元膜蛋白1(SNMP1)，表達(dá)在嗅覺(jué)感知神經(jīng)元(OSN)中，具有檢測(cè)脂源信息素的功能。SNMP1通常存在于昆蟲(chóng)的樹(shù)突狀纖毛中，氣味受體(ORs，圖一) 也位于這里。在OSN中，已知果蠅 SNMP1 的功能是檢測(cè)雄性信息素(Z)-1-八度乙酸 (cis-vaccenylacetate,  cVA) 。缺乏 SNMP1 時(shí)會(huì)降低這些神經(jīng)元對(duì)cVA 刺激的敏感性。因此，SNMP1 在此信號(hào)通路中起著重要的作用，但其作用機(jī)制尚不明確。盡管如此，SNMP1與細(xì)胞外脂質(zhì)配體的相互作用進(jìn)而引發(fā)信號(hào)通路下游反應(yīng)，與哺乳動(dòng)物 CD36 在脂肪味覺(jué)感知、病原性細(xì)菌脂質(zhì)、脂蛋白的免疫識(shí)別方面類(lèi)似1,2。因此，SNMP1 為理解體內(nèi) CD36蛋白提供了一個(gè)相關(guān)的模型。

因?yàn)榫哂袩o(wú)標(biāo)記和實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的特點(diǎn)，表面等離子共振(SPR) 技術(shù)在研究生物分子相互作用時(shí)有明顯優(yōu)勢(shì)。在這篇應(yīng)用筆記里，我們將說(shuō)明如何用 P4SPR 來(lái)研究不同昆蟲(chóng)信息素和 CD36 蛋白的結(jié)合作用，提供一個(gè)分子遺傳學(xué)，細(xì)胞生物學(xué)，生化，電生理學(xué)和同源建模的補(bǔ)充技術(shù)來(lái)表征SNMP1 的結(jié)構(gòu)功能。最終的目標(biāo)是綜合概述跨膜蛋白在興奮劑的刺激下所顯示的作用機(jī)制。

實(shí)驗(yàn)設(shè)置
P4SPR 設(shè)備設(shè)置

圖二  P4SPR與蠕動(dòng)泵相連工作示意圖

USB供電個(gè)人型四通道 SPR (P4SPR) 連接到筆記本后可經(jīng)過(guò)P4SPR控制軟件控制和記錄數(shù)據(jù)。蠕動(dòng)泵模塊可輕松集成到 P4SPR 實(shí)驗(yàn)中，以確保穩(wěn)定的液流到 SPR 芯片上( 圖二) 。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前需要先把Au SPR芯片插入P4SPR 的流動(dòng)池支架中。PDMS 微流體單元放置在 SPR 芯片頂部，并在 P4SPR 蓋上牢固地施加壓力以避免任何液體泄漏。為設(shè)備進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的設(shè)置流程不多于 5分鐘的準(zhǔn)備時(shí)間。

實(shí)驗(yàn)程序

圖三   CD36傳感芯片及其與小分子相互作用SPR實(shí)驗(yàn)示意圖

首先Au SPR芯片的表面涂有肽自組裝的單層以結(jié)合帶有His標(biāo)簽的蛋白質(zhì)，其功能類(lèi)似于Ni-NTA。由于SNMP1的胞外域難以表達(dá)，鑒于結(jié)構(gòu)特征的同源性，本研究過(guò)程使用哺乳動(dòng)物CD36作為結(jié)合研究的替代品。高濃度的 His-tagged 標(biāo)記的CD36蛋白溶液在芯片表面孵育15分鐘后完成CD36的固定 (圖三)。實(shí)驗(yàn)中總共研究了9個(gè)信息素分子與CD36蛋白的結(jié)合相互作用。配體在 PBS 中制備的濃度在亞uM和mM之間。PBS中加入0.1%的二甲基硫氧化物提高疏水配體的溶解度。從固定到分析的每個(gè)SPR步驟都可實(shí)時(shí)監(jiān)控。配體溶液從低濃度到高濃度依次注入。每個(gè)配體的分析時(shí)間是 30 分鐘，其中包括 6 種不同的濃度流經(jīng)P4SPR。SPR 位移在熱力學(xué)平衡后做記錄并繪制，以確定每個(gè)配體的親和曲線。平衡解離常數(shù) (KD)和最大SPR信號(hào)可通過(guò)Matlab擬合 Langmuir 等溫線到親和力曲線來(lái)提取。

結(jié)果和討論
SPR傳感器圖

圖四  SPR傳感圖：法呢醇(濃度:0.29-73.4uM)和cVA (濃度: 0.33-83.7uM) (左)；
(Z)-11-16 烯醛(濃度: 0.18-47.0uM)和乙酸異戊酯(濃度: 0.32-327uM) (右)

SPR 傳感圖的結(jié)果顯示隨著法呢醇，CVA 和(Z)-11-16烯醛濃度增加，SPR 位移也相對(duì)增加。對(duì)于乙酸異戊酯未觀察到 SPR 位移表明與CD36幾乎沒(méi)有結(jié)合。

配體濃度-響應(yīng)曲線與 KD 比較
為了比較，我們建立了各種分析物的濃度響應(yīng)曲線。通過(guò)SPR 檢測(cè)，5個(gè)信息素分子顯示與CD36結(jié)合（圖五）。檢測(cè)CVA、法呢醇和(Z)-11-16 烯醛得到的解離常數(shù)和一些已知的CD36結(jié)合肽的檢測(cè)結(jié)果在相同量級(jí)(圖六)³
 

圖五  所示配體的 ΔλSPR 濃度-響應(yīng)曲線，用于計(jì)算相應(yīng)的平衡解離常數(shù)
 

圖六  化合物的 KD 和最大 SPR 信號(hào) (ΔλSPR,max)

特異性和靈敏度
信息素與CD36相互作用的特異性在本文中得到驗(yàn)證。已知僅激活非 SNMP1 表達(dá)神經(jīng)元（乙酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸己酯或丁酸乙酯）的其他刺激物無(wú)顯著相互作用（圖六），表明了昆蟲(chóng)信息素與 CD36 外域直接結(jié)合的證據(jù)。此外，P4SPR 對(duì)研究 88-250Da 之間分子量配體的結(jié)合具有足夠的靈敏度。這表明 P4SPR 能夠通過(guò)相關(guān)的表面修飾獲得互作檢測(cè)的特異性，并能檢測(cè)低分子量的小分子。

P4SPR優(yōu)勢(shì)
Affinité instruments 的P4SPR是一個(gè)模塊化、個(gè)人型的多通道分子互作系統(tǒng)，用于提供對(duì)這些跨膜蛋白在信息素刺激下的作用機(jī)制的基本理解。它的模塊化允許與液流傳輸系統(tǒng)輕松集成。多通道特性提高了測(cè)量精度，其靈敏度允許檢測(cè)低分子量的小分子。對(duì)于采用多種方法來(lái)理解生物功能背后的作用機(jī)制的綜合研究，特異性強(qiáng)、靈敏度高且用戶友好的P4SPR 系統(tǒng)非常適合于快速收集SPR 數(shù)據(jù)來(lái)表征結(jié)合相互作用。

結(jié)論
P4SPR 提供的相互作用結(jié)合信息，進(jìn)一步證明了信息素與跨膜蛋白的直接結(jié)合，其是信息素在細(xì)胞內(nèi)的隧道效應(yīng)的主要來(lái)源。P4SPR 為不同信息素和 CD36 的結(jié)合作用和特異性提供了寶貴的信息，進(jìn)一步揭示了其作用機(jī)制。

參考文獻(xiàn)

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【3】Bolduc, O. R. et al. Modified peptide monolayer binding His-tagged biomolecules for small ligand screening with SPR biosensors. Analyst 136, 3142–3148 (2011).