揭示小鼠胚胎母源-合子轉(zhuǎn)換過程中的RNA m6A動態(tài)

母源-合子轉(zhuǎn)化(MZT)是卵母細胞由母源環(huán)境向合子基因組驅(qū)動的表達程序轉(zhuǎn)變的一個基本而保守的過程，這一過程將最終分化的卵母細胞和精子重新編程為全能性狀態(tài)。MZT是由母體mRNA和蛋白質(zhì)啟動，隨后逐漸轉(zhuǎn)為合子基因組激活（ZGA），并伴隨著母源RNA和蛋白質(zhì)的清除。胚胎發(fā)育的一個關(guān)鍵問題是MZT如何被調(diào)節(jié)。然而，盡管母體沉積的快速清除的mRNA和新合成的合子RNA產(chǎn)物在推動早期胚胎發(fā)生方面具有重要意義，但RNA控制的各種機制仍然知之甚少。N6-甲基腺苷(m⁶A)是高等真核生物信使RNA (mRNA)中最常見的內(nèi)部修飾，在細胞命運維持和轉(zhuǎn)變過程中發(fā)揮重要作用。但是m⁶A修飾對MZT過程中RNA代謝的潛在調(diào)節(jié)作用尚不清楚。

2023年4月，中國科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心（神經(jīng)科學(xué)研究所）劉真研究組、孫怡迪研究組與上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院單細胞組學(xué)與疾病研究中心李辰研究組合作在Genome Biology（IF 17.906）期刊發(fā)表了題為“Reading and writing of mRNA m⁶A modification orchestratematernal-to-zygotic transition in mice”的研究論文。該研究利用SLIM-seq技術(shù)繪制出小鼠胚胎母源-合子轉(zhuǎn)換過程中RNA m⁶A修飾動態(tài)圖譜，并通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析和CRISPR/Cas13d介導(dǎo)基因敲低揭示m⁶A的讀寫對于小鼠著床前胚胎發(fā)育的影響。中科新生命為研究提供4D-DIA蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)支持。
 

 研究材料

 技術(shù)路線

步驟1：MZT期間m⁶A標記mRNA的動態(tài)圖譜分析；

步驟2：m⁶A修飾功能分析：促進RNA衰變，亦可維持RNA穩(wěn)定；

步驟3：m⁶A修飾通過維持mRNA的穩(wěn)定性調(diào)控MZT；

步驟4：Ythdc1結(jié)合m⁶A修飾的mRNA并調(diào)控其穩(wěn)定性。

 研究內(nèi)容
 

1. MZT期間m⁶A標記mRNA的動態(tài)圖譜分析

為了揭示MZT期間m⁶A的動態(tài)圖譜，作者對小鼠的MII卵母細胞、晚期1細胞(L1C)和晚期2細胞(L2C)胚胎進行SLIM-seq（微量樣本m⁶A測序技術(shù)）分析(圖1a)。SLIM-seq中共鑒定到3396個m⁶A標記的mRNAs和973個m⁶A標記的ncRNAs（圖1b）。與RNA-seq對比分析發(fā)現(xiàn)m⁶A標記的mRNA數(shù)量在受精后顯著減少，而在合子基因組激活(ZGA)期間增加，在不同階段，m⁶A水平的變化與m⁶A標記mRNA數(shù)量的變化相同，揭示了早期胚胎發(fā)育過程中m⁶A動態(tài)的三種主要模式：母體丟失、一致遺傳和新生獲得(圖1c-1e)。綜上所述，小鼠MZT期間m⁶A標記的mRNA呈現(xiàn)高度動態(tài)變化。

2. m⁶A修飾功能分析：促進RNA衰變，亦可維持RNA穩(wěn)定

卵母細胞的成熟和受精均伴隨RNA的降解，之前的研究表明m⁶A結(jié)合蛋白Ythdf2在母體RNA衰變中發(fā)揮重要作用。m⁶A是否參與了受精后RNA的降解仍未知。SLIM-seq分析發(fā)現(xiàn)982個m⁶A標記的基因在MII卵母細胞中特異性富集而在受精后丟失,且近半的標記基因其mRNA表達水平下降，表明m⁶A對這些mRNA具有促衰變作用。1243個基因從L1C到L2C中被m⁶A新標記，即在是受精后重新產(chǎn)生，且近半新標記的基因的mRNA表達水平增加。另外發(fā)現(xiàn)609個m⁶A標記基因一致地從MII卵母細胞遺傳到L2C胚胎，其mRNA水平上亦沒有變化（圖1f-1g）。綜上所述，除了促進RNA衰變外，m⁶A修飾還參與維持RNA的穩(wěn)定性。

圖1 小鼠MZT期間m⁶A動態(tài)圖譜分析和功能分析

 

3. m⁶A修飾通過維持mRNA的穩(wěn)定性調(diào)控MZT

由于m⁶A修飾的基因是遺傳的，故作者推測這些mRNA是為了促進翻譯而維持的，并與哈佛大學(xué)張毅團隊發(fā)表的同時期LiRibo-seq翻譯圖譜進行比對分析。結(jié)果顯示，在609個m⁶A標記基因中，LiRibo-seq數(shù)據(jù)中可檢測到559個(圖2a)，且其中大多數(shù)基因在L1C和L2C階段翻譯水平升高，表明母系遺傳的m⁶A標記mRNA在此階段進行了翻譯（圖2b）。隨后作者采用4D-DIA蛋白質(zhì)組學(xué)的方法進一步驗證，每個蛋白質(zhì)組樣品僅使用20個小鼠卵母細胞或胚胎細胞，共檢測到5328個基因編碼的5353種蛋白質(zhì)。其中LiRibo-seq數(shù)據(jù)中可檢測到的559個基因中有333個基因在蛋白質(zhì)組學(xué)中亦檢測到了。聚類分析發(fā)現(xiàn)在MZT期間，大多數(shù)基因的表達水平保持或增加。GO分析結(jié)果顯示，這些基因顯著富集在mRNA和蛋白酶體調(diào)控中(圖2c-2h)。綜上，母系遺傳的m⁶A標記的mRNA通過維持穩(wěn)定性用于翻譯，進而調(diào)控MZT。

 

4. Ythdc1結(jié)合m⁶A修飾的mRNA并調(diào)控其穩(wěn)定性

mRNA的m⁶A修飾受多方面的調(diào)控：甲基轉(zhuǎn)移酶、脫甲基酶和 m⁶A結(jié)合蛋白，它們在早期胚胎發(fā)育的不同階段發(fā)揮不同的作用。為了探究這些蛋白質(zhì)對mRNA功能的影響，作者采用CRISPR/Cas13d技術(shù)同時敲低小鼠受精卵中m6A的調(diào)控因子Ythdc1和Ythdf2，發(fā)現(xiàn)可以顯著影響小鼠著床前胚胎發(fā)育（圖2i）。為進一步研究Ythdc1對m⁶A標記的mRNA的影響，敲低Ythdc1的胚胎進行了轉(zhuǎn)錄組測序和RNA免疫沉淀(RIP)-qPCR等實驗，結(jié)果表明Ythdc1可以結(jié)合一些母源攜帶m⁶A的轉(zhuǎn)錄本，并參與其RNA穩(wěn)定性調(diào)控(圖2j-2o）。

圖2 母系遺傳的m⁶A修飾維持mRNA的穩(wěn)定性并與蛋白質(zhì)翻譯有關(guān)

 

 小結(jié)

該研究揭示了小鼠MZT過程中的m⁶A修飾的動態(tài)變化，鑒定了少量參與著床前胚胎發(fā)育的m⁶A調(diào)控分子，初步闡明了Ythdc1可能參與母源繼承m⁶A轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性調(diào)控，體現(xiàn)了多組學(xué)分析在胚胎發(fā)育研究中的重要性。

 

閱讀原文

https://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13059-023-02918-9

參考文獻

Yin et al., Cell Stem Cell, 2021

Zhang et al., Sci Adv. 2022

Gu et al., bioRxiv, 2023

Kushawah et al., Dev Cell, 2020