Vaspin靶向AMPK信號通路通過GRP78受體減輕脂肪變性誘導的纖維化
非酒精性脂肪性肝病 （NAFLD） 是一種多因素疾病，通常與肥胖、2型糖尿病（T2D）、高脂血癥和代謝綜合征有關(guān)。雖然參與NAFLD發(fā)展的確切分子機制尚不清楚，但肝細胞FFA（游離脂肪酸）積累和脂毒性與幾個基因功能有關(guān)，這些基因功能增加FFA攝�。ㄈ鏑aveolin-1和FABP4）和脂肪生成（如FAS，SCD-1和SREBP-1c）并減少脂肪酸β-氧化（如CPT1和MCAD）和分泌（如apoB100）。已經(jīng)證明，Caveolin-1 和 FABP4 蛋白水平與脂肪變性、炎癥和纖維化的嚴重程度相關(guān)。SREBP1c是成脂基因（包括FAS）表達的主要轉(zhuǎn)錄因子，在維持靜息狀態(tài)的肝星狀細胞（HSC）的纖維化機制中起主要作用。CPT1位于線粒體外膜，促進脂肪酸進入線粒體進行β-氧化并降低CPT1，導致ROS生成和炎癥。此外，apoB100是肝細胞VLDL（極低密度脂蛋白）分泌和維持脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵成分。
這些基因的表達水平主要受 5′ AMP 活化蛋白激酶 （AMPK） 活性的影響。增加細胞AMP/ATP比值刺激AMPK磷酸化，抑制脂肪酸（FA）的重新合成，激活FA氧化，并通過抑制細胞因子誘導的核因子-κB（NF-κB）的產(chǎn)生來誘導抗炎作用。已有研究表明，含pyrin結(jié)構(gòu)域NOD樣受體家族3（NLRP3）的炎癥小體的激活與肝脂肪變性的進展密切相關(guān)。NLRP3炎癥小體無疑是代謝炎癥和肝纖維化的重要介質(zhì)。
內(nèi)臟脂肪組織來源的絲氨酸蛋白酶抑制劑（vaspin）是由脂肪細胞、肝細胞和其他幾種組織釋放的脂肪因子，由于其改善胰島素抵抗和抗動脈粥樣硬化的能力而受到廣泛關(guān)注，它在激活各種信號通路中起主要作用。Vaspin可作為內(nèi)皮細胞和卵巢細胞以及活化的蛋白激酶A（PKA）信號通路中GRP78受體的配體。也有報道稱，vaspin與肝脂肪變性以及纖維化進展密切相關(guān)。
鑒于沒有關(guān)于vaspin對脂肪變性和肝纖維化發(fā)展中細胞代謝影響的分子機制研究，伊朗庫爾德斯坦醫(yī)科大學研究團隊曾試圖詳細闡明vaspin對相關(guān)基因、信號通路和炎癥標志物表達的可能影響，還使用具有HepG2（人肝癌細胞系）和LX-2（人肝星形細胞）細胞系的NAFLD細胞模型研究了纖維化相關(guān)過程。
細胞內(nèi)脂質(zhì)積累和細胞活力測定
為了研究脂肪變性的細胞模型，使用熒光顯微鏡和流式細胞術(shù)觀察并確認了FFA積累。結(jié)果表明，與對照組相比，細胞內(nèi)FFA含量增加了（27.9%）。然后使用MTT測量FFA處理的細胞的活力以及HepG2細胞的vaspin的活性。結(jié)果表明，在用 1.2 mM FFA 和 50、100 和 300 ng/ml vaspin 處理的細胞中未觀察到與處理相關(guān)的細胞死亡。在共培養(yǎng)的HepG2 + LX-2細胞系中也觀察到了類似的結(jié)果。
vaspin對FFA處理的HepG2細胞系中Caveolin-1、FABP4和apoB100基因表達的影響
Vaspin改變了FFA處理的HepG2細胞系中Caveolin-1、FABP4和apoB100的表達水平。圖1顯示，與未處理組相比，F(xiàn)FA處理的細胞中基因表達顯著增加。24 小時后，vaspin（50、100、300 ng/ml）顯著降低Caveolin-1表達，并降低FABP4基因表達，但這些變化不顯著。apoB100的表達水平較對照組顯著升高。用1:2000稀釋的GRP78-Ab溶液處理細胞從而抑制GRP78受體，這顯著阻斷了三種濃度下vaspin對Caveolin-1和apoB100表達水平的影響。
圖1 50、100、300 ng/ml vaspin處理和阻斷GRP78受體對相關(guān)FA攝取和分泌基因表達的影響。Vaspin降低了FFA處理的HepG2細胞系中的Caveolin-1，apoB100表達。通過單獨RT-qPCR并與FFA處理的HepG2細胞系中的GRP78-Ab共處理24 h 分析Vaspin對Caveolin-1，F(xiàn)ABP4和apoB100基因表達的影響。
Vaspin降低了FFA處理的HepG2細胞系中的SCD-1、FAS和SREBP-1c表達
接下來實驗評估了參與脂肪生成的SCD-1，F(xiàn)AS和SREBP-1c的基因表達。FFA處理24小時后，3種基因的表達水平均顯著升高。與對照組相比，用vaspin處理逆轉(zhuǎn)了SCD-1，SREBP-1c（在所有三種濃度下）和FAS（100 ng/ml）的這種表達。
與vaspin 相同濃度的處理相比，vaspin與GRP78-Ab的聯(lián)合處理顯著逆轉(zhuǎn)了SCD-1和SREBP-1c表達的降低。在FAS基因表達中，與相同濃度的vaspin單獨處理相比，同時用vaspin和GRP78-Ab處理細胞沒有觀察到顯著增加。
Vaspin增加了FFA處理的HepG2細胞系中的CPT1和MCAD表達
為了研究vaspin抑制肝臟脂肪變性的機制，實驗測量了參與肝β-氧化的關(guān)鍵基因的表達，包括CPT1和MCAD。FFA處理24小時后CPT1和MCAD基因表達下降，對MCAD有統(tǒng)計學意義。所有濃度的vaspin均顯著增加MCAD的表達，而100 ng/ml濃度顯著增加CPT1的表達。但是當細胞同時用vaspin和GRP78-Ab處理時，這些表達的升高在CPT1（100 ng/ml 下）和MCAD（所有濃度下）中得到顯著抑制（圖2）。
圖2 Vaspin增加FFA處理的HepG2細胞系中CPT1和MCAD基因的表達。通過RT-qPCR 分析并與FFA 處理的 HepG2 細胞系中 GRP78 Ab 共處理24 h 分析50、100、300 ng/ml vaspin 對CPT1和 MCAD 基因的影響。
Vaspin在FFA處理的HepG2中增加AMPK活性
實驗還研究了vaspin對AMPK活性的刺激作用。與對照組相比，濃度為50、100和300 ng/ml的vaspin處理的細胞在24小時內(nèi)顯著增加AMPK活性。與相同濃度的vaspin相比，用vaspin和GRP78-Ab共同處理細胞抑制了這種升高，并在50和100 ng/ml濃度下顯著降低了AMPK的活性。
Vaspin降低了HepG2和LX-2細胞系共培養(yǎng)纖維化模型中NF-κB和TGF-β1的表達
與FFA處理的細胞相比，F(xiàn)FA和100 ng/ml vaspin同時處理共培養(yǎng)的HepG2和LX-2細胞顯著降低了NF-κB和TGF-β1表達（圖3 a、b）。與FFA處理的細胞相比，MCC950（NLRP3抑制劑）處理組NF-κB和TGF-β1的基因表達也降低（圖3 a、b）。值得注意的是，vaspin在降低TGF-β1表達方面比MCC950更有效（圖3 b）。研究發(fā)現(xiàn)，與vaspin和MCC950組的個體效應(yīng)相比，vaspin和MCC950的共同處理顯著降低了TGF-β1和NF-κB的基因表達。這表明vaspin+MCC950具有協(xié)同作用（圖3 a、b）。
圖3 Vaspin降低了FFA處理的HepG2和LX-2細胞系中的NF-κB和TGF-β1基因表達。通過RT-qPCR分析MCC950，100 ng/ml vaspin和vaspin+MCC950對HepG2和LX-2共培養(yǎng)細胞中NF-κB和TGF-β1基因的影響。
Vaspin降低了HepG2和LX-2細胞系共培養(yǎng)纖維化模型中TGF-β1和α-SMA的蛋白質(zhì)水平
與各自的對照組相比，Vaspin（100 ng/ml）顯著降低了FFA處理（96小時）的共培養(yǎng)的HepG2和LX-2細胞中TGF-β1和α-SMA的蛋白質(zhì)水平（圖4 b、c）。同樣，與FFA處理組相比，MCC950處理組的TGF-β1和α-SMA蛋白顯著減弱。這一結(jié)果表明，與MCC950相比，vaspin在降低TGF-β1方面比α-SMA具有更強的潛在作用。
圖4 Vaspin可減輕共培養(yǎng)的FFA處理的HepG2和LX-2細胞系中的肝纖維化。HepG2和LX-2共培養(yǎng)的細胞用MCC950，100 ng/ml vaspin 和vaspin+MCC950處理。通過蛋白質(zhì)印跡分析TGF-β1和α-SMA蛋白水平。
總之，該研究的數(shù)據(jù)首次表明，vaspin減少了細胞模型中的炎癥和纖維化。實驗觀察到，vaspin通過降低參與脂肪生成和FA攝取的基因表達，同時通過GRP78受體和AMPK信號通路增加氧化和FA分泌，從而減少了肝細胞中的FA積累。這表明 vaspin 可被視為肝纖維化的潛在抗脂肪變性和抗纖維化劑。
參考文獻：Abdolahi A, Vahabzadeh Z, Izadpanah E, Moloudi MR. Vaspin attenuates steatosis-induced fibrosis via GRP78 receptor by targeting AMPK signaling pathway. J Physiol Biochem. 2022 Feb;78(1):185-197. doi: 10.1007/s13105-021-00852-7. Epub 2022 Jan 10. PMID: 35001345.
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這些基因的表達水平主要受 5′ AMP 活化蛋白激酶 （AMPK） 活性的影響。增加細胞AMP/ATP比值刺激AMPK磷酸化，抑制脂肪酸（FA）的重新合成，激活FA氧化，并通過抑制細胞因子誘導的核因子-κB（NF-κB）的產(chǎn)生來誘導抗炎作用。已有研究表明，含pyrin結(jié)構(gòu)域NOD樣受體家族3（NLRP3）的炎癥小體的激活與肝脂肪變性的進展密切相關(guān)。NLRP3炎癥小體無疑是代謝炎癥和肝纖維化的重要介質(zhì)。
內(nèi)臟脂肪組織來源的絲氨酸蛋白酶抑制劑（vaspin）是由脂肪細胞、肝細胞和其他幾種組織釋放的脂肪因子，由于其改善胰島素抵抗和抗動脈粥樣硬化的能力而受到廣泛關(guān)注，它在激活各種信號通路中起主要作用。Vaspin可作為內(nèi)皮細胞和卵巢細胞以及活化的蛋白激酶A（PKA）信號通路中GRP78受體的配體。也有報道稱，vaspin與肝脂肪變性以及纖維化進展密切相關(guān)。
鑒于沒有關(guān)于vaspin對脂肪變性和肝纖維化發(fā)展中細胞代謝影響的分子機制研究，伊朗庫爾德斯坦醫(yī)科大學研究團隊曾試圖詳細闡明vaspin對相關(guān)基因、信號通路和炎癥標志物表達的可能影響，還使用具有HepG2（人肝癌細胞系）和LX-2（人肝星形細胞）細胞系的NAFLD細胞模型研究了纖維化相關(guān)過程。
細胞內(nèi)脂質(zhì)積累和細胞活力測定
為了研究脂肪變性的細胞模型，使用熒光顯微鏡和流式細胞術(shù)觀察并確認了FFA積累。結(jié)果表明，與對照組相比，細胞內(nèi)FFA含量增加了（27.9%）。然后使用MTT測量FFA處理的細胞的活力以及HepG2細胞的vaspin的活性。結(jié)果表明，在用 1.2 mM FFA 和 50、100 和 300 ng/ml vaspin 處理的細胞中未觀察到與處理相關(guān)的細胞死亡。在共培養(yǎng)的HepG2 + LX-2細胞系中也觀察到了類似的結(jié)果。
vaspin對FFA處理的HepG2細胞系中Caveolin-1、FABP4和apoB100基因表達的影響
Vaspin改變了FFA處理的HepG2細胞系中Caveolin-1、FABP4和apoB100的表達水平。圖1顯示，與未處理組相比，F(xiàn)FA處理的細胞中基因表達顯著增加。24 小時后，vaspin（50、100、300 ng/ml）顯著降低Caveolin-1表達，并降低FABP4基因表達，但這些變化不顯著。apoB100的表達水平較對照組顯著升高。用1:2000稀釋的GRP78-Ab溶液處理細胞從而抑制GRP78受體，這顯著阻斷了三種濃度下vaspin對Caveolin-1和apoB100表達水平的影響。
Vaspin降低了FFA處理的HepG2細胞系中的SCD-1、FAS和SREBP-1c表達
接下來實驗評估了參與脂肪生成的SCD-1，F(xiàn)AS和SREBP-1c的基因表達。FFA處理24小時后，3種基因的表達水平均顯著升高。與對照組相比，用vaspin處理逆轉(zhuǎn)了SCD-1，SREBP-1c（在所有三種濃度下）和FAS（100 ng/ml）的這種表達。
與vaspin 相同濃度的處理相比，vaspin與GRP78-Ab的聯(lián)合處理顯著逆轉(zhuǎn)了SCD-1和SREBP-1c表達的降低。在FAS基因表達中，與相同濃度的vaspin單獨處理相比，同時用vaspin和GRP78-Ab處理細胞沒有觀察到顯著增加。
Vaspin增加了FFA處理的HepG2細胞系中的CPT1和MCAD表達
為了研究vaspin抑制肝臟脂肪變性的機制，實驗測量了參與肝β-氧化的關(guān)鍵基因的表達，包括CPT1和MCAD。FFA處理24小時后CPT1和MCAD基因表達下降，對MCAD有統(tǒng)計學意義。所有濃度的vaspin均顯著增加MCAD的表達，而100 ng/ml濃度顯著增加CPT1的表達。但是當細胞同時用vaspin和GRP78-Ab處理時，這些表達的升高在CPT1（100 ng/ml 下）和MCAD（所有濃度下）中得到顯著抑制（圖2）。
Vaspin在FFA處理的HepG2中增加AMPK活性
實驗還研究了vaspin對AMPK活性的刺激作用。與對照組相比，濃度為50、100和300 ng/ml的vaspin處理的細胞在24小時內(nèi)顯著增加AMPK活性。與相同濃度的vaspin相比，用vaspin和GRP78-Ab共同處理細胞抑制了這種升高，并在50和100 ng/ml濃度下顯著降低了AMPK的活性。
Vaspin降低了HepG2和LX-2細胞系共培養(yǎng)纖維化模型中NF-κB和TGF-β1的表達
與FFA處理的細胞相比，F(xiàn)FA和100 ng/ml vaspin同時處理共培養(yǎng)的HepG2和LX-2細胞顯著降低了NF-κB和TGF-β1表達（圖3 a、b）。與FFA處理的細胞相比，MCC950（NLRP3抑制劑）處理組NF-κB和TGF-β1的基因表達也降低（圖3 a、b）。值得注意的是，vaspin在降低TGF-β1表達方面比MCC950更有效（圖3 b）。研究發(fā)現(xiàn)，與vaspin和MCC950組的個體效應(yīng)相比，vaspin和MCC950的共同處理顯著降低了TGF-β1和NF-κB的基因表達。這表明vaspin+MCC950具有協(xié)同作用（圖3 a、b）。
Vaspin降低了HepG2和LX-2細胞系共培養(yǎng)纖維化模型中TGF-β1和α-SMA的蛋白質(zhì)水平
與各自的對照組相比，Vaspin（100 ng/ml）顯著降低了FFA處理（96小時）的共培養(yǎng)的HepG2和LX-2細胞中TGF-β1和α-SMA的蛋白質(zhì)水平（圖4 b、c）。同樣，與FFA處理組相比，MCC950處理組的TGF-β1和α-SMA蛋白顯著減弱。這一結(jié)果表明，與MCC950相比，vaspin在降低TGF-β1方面比α-SMA具有更強的潛在作用。
總之，該研究的數(shù)據(jù)首次表明，vaspin減少了細胞模型中的炎癥和纖維化。實驗觀察到，vaspin通過降低參與脂肪生成和FA攝取的基因表達，同時通過GRP78受體和AMPK信號通路增加氧化和FA分泌，從而減少了肝細胞中的FA積累。這表明 vaspin 可被視為肝纖維化的潛在抗脂肪變性和抗纖維化劑。
參考文獻：Abdolahi A, Vahabzadeh Z, Izadpanah E, Moloudi MR. Vaspin attenuates steatosis-induced fibrosis via GRP78 receptor by targeting AMPK signaling pathway. J Physiol Biochem. 2022 Feb;78(1):185-197. doi: 10.1007/s13105-021-00852-7. Epub 2022 Jan 10. PMID: 35001345.
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