噬菌體展示文庫構(gòu)建全流程

1.什么是噬菌體展示
噬菌體文庫是用于基因克隆的噬菌體載體，噬菌體展示文庫是將外源蛋白或多肽與噬菌體外殼蛋白融合，展示在噬菌體表面并保持特定的空間構(gòu)象，利用特異性親和作用以篩選特異性蛋白或多肽的一項新技術(shù)。 2.噬菌體文庫類型
卡梅德生物在抗體領(lǐng)域研究多年，我們構(gòu)建的噬菌體展示技術(shù)服務(wù)涵蓋了多種文庫類型，包涵羊駝/駱駝VHH抗體庫，人源噬菌體文庫，人源SscFV抗體庫，人源Fab抗體文庫，噬菌體肽庫，預(yù)制肽文庫等多種優(yōu)質(zhì)的抗體庫，可根據(jù)客戶的需求提供定制服務(wù)，并提供靈活有效的篩選服務(wù)。
 
3.噬菌體文庫篩選應(yīng)用
噬菌體展示文庫技術(shù)是一種新興的生物技術(shù)，利用噬菌體展示技術(shù)獲得的外源蛋白保持獨立的空間結(jié)構(gòu)和生物活性，目前在新型疫苗的研制，酶抑制劑的篩選，醫(yī)學(xué)診斷和治療，多肽藥物的開發(fā)，抗原表位分析，單抗篩選，蛋白相互作用的研究等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，并顯示了良好的應(yīng)用前景。
 
4.噬菌體文庫構(gòu)建的技術(shù)優(yōu)勢
（1）篩選容量大、可發(fā)酵大量生產(chǎn)、方法簡單，目前我們獲得的噬菌體一級免疫文庫的庫容可達(dá)10⁸-10⁹，其序列豐度>99%，保證直接篩選獲得的抗體親和力達(dá)到nM甚至pM級別。
（2）將基因型與表型、分子結(jié)合活性與噬菌體的可擴增性結(jié)合在一起，是一種篩選新技術(shù)。
（3）快速制備可溶抗原，結(jié)合公司現(xiàn)有的重組蛋白表達(dá)體系，能夠在短時間內(nèi)制備出高純度、高生物學(xué)活性的可溶抗原蛋白，用以支持噬菌體抗體的免疫及篩選工作。
 
5.卡梅德生物能夠為客戶提供高質(zhì)量的噬菌體文庫構(gòu)建服務(wù)
M13單鏈絲狀噬菌體展示系統(tǒng)是目前應(yīng)用較廣泛的文庫展示系統(tǒng)，通過將蛋白、抗體或多肽與噬菌體pIII蛋白融合表達(dá)，使之參與噬菌體組裝，并展示在噬菌體表面，形成噬菌體展示文庫，卡梅德生物利用M13絲狀噬菌體殼蛋白pIII和PVIII展示技術(shù)，能夠為客戶構(gòu)建不同物種的天然或者免疫的噬菌體抗體展示文庫，通過抗體庫技術(shù)制備多物種單克隆抗體，如人，鼠，兔，雞，羊，鵝，豬，牛，馬，驢，駱駝，羊駝，鯊魚等物種來源的單克隆抗體，可根據(jù)客戶的需求提供定制服務(wù)，并且?guī)烊萘靠蛇_(dá)10¹¹。
 
6.卡梅德生物為客戶提供噬菌體文庫構(gòu)建服務(wù)的全流程介紹
卡梅德生物為客戶提供噬菌體文庫構(gòu)建服務(wù)，流程包括：總RNA提取，反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA，PCR擴增，載體與 PCR 產(chǎn)物酶切連接，細(xì)菌文庫構(gòu)建，噬菌體文庫構(gòu)建，噬菌體文庫效價檢測。 6.1總RNA提取
將外周血淋巴細(xì)胞從冰箱取出后分裝，加入氯仿，離心后取上清加入異丙醇，離心保留沉淀，加入75%乙醇后離心保留沉淀，干燥后加入DEPC水，孵育確保RNA溶解，將各管混合到一管中即為總RNA，取1μl總RNA進(jìn)行電泳，取2μl用核酸濃度測量儀測濃度。  
6.2反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA
按照商業(yè)化試劑盒操作說明書進(jìn)行cDNA制備，將上一步得到的RNA一分為二反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反轉(zhuǎn)錄引物分別用Oligo dTprimer及random 6-mers。
 
6.3PCR擴增
6.3.1第一輪PCR
以 cDNA 為模板進(jìn)行第一輪PCR反應(yīng)，使用HS Ex Taq酶進(jìn)行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系為：

試劑	使用量
cDNA	0.5-5μl
AlpVh-L/CALL 002	2μl/2μl
dNTP Mix	4μl
10×ExTaq Buffer	5μl
HS Ex Taq	0.25μl
ddH2O	Up to 50μl

 
將得到的PCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，找到目的條帶進(jìn)行上述條件PCR擴增，將所有PCR產(chǎn)區(qū)進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，使用通用型DNA純化回收試劑盒對切膠的膠條進(jìn)行DNA回收。  
6.3.2 第二輪PCR
以上一步PCR擴增并回收后的DNA片段作為模板再次擴增特定的抗體片段，PCR 反應(yīng)體系為：
 

試劑	使用量
第一輪 PCR 回收產(chǎn)物	0.1-2μl
Rvhh FP/RvhhRP	2μl/2μl
dNTP Mix	4μl
10×ExTaq Buffer	5μl
HS Ex Taq	0.25μl
ddH2O	Up to 50μl

 
將得到的PCR擴增產(chǎn)物使用DNA純化回收試劑盒按說明書回收。 6.4載體與PCR產(chǎn)物酶切連接
第二輪PCR產(chǎn)物通過酶切連接到噬菌體質(zhì)粒pADL-10b中，從而構(gòu)建含有擴增片段的噬菌體質(zhì)粒庫。將連接產(chǎn)物使用DNA純化回收試劑盒按說明書回收，分別取2μl用核酸濃度測量儀檢測回收產(chǎn)物的濃度。
6.5細(xì)菌文庫構(gòu)建
將連接產(chǎn)物進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化后構(gòu)建含有目的抗體片段的大腸桿菌文庫。
取SS320大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，加入回收后的連接產(chǎn)物，將混合后的感受態(tài)細(xì)胞和連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到預(yù)冷好的電轉(zhuǎn)杯中，使用電轉(zhuǎn)儀預(yù)設(shè)的轉(zhuǎn)化程序電擊轉(zhuǎn)化，電轉(zhuǎn)后立即往電轉(zhuǎn)杯中加入950μlSOC培養(yǎng)基，至少進(jìn)行20個電轉(zhuǎn)。將細(xì)胞復(fù)蘇后涂在含有氨芐抗性的瓊脂糖培養(yǎng)板上過夜生長。將上一步過夜生長后的培養(yǎng)板上的細(xì)胞用2xYT培養(yǎng)基和涂布棒沖洗刮下，加入20%的甘油測OD600nm值后保存在-80℃，即為細(xì)菌文庫。
 
  6.6噬菌體文庫構(gòu)建
6.6.1噬菌體文庫擴增
將上一步刮下的菌體混勻后轉(zhuǎn)移到100 mL預(yù)先加入四環(huán)素的2x YT培養(yǎng)液中，37℃，250rpm培養(yǎng)直至OD600nm達(dá)到0.5-0.55。
按照輔助噬菌體：細(xì)菌細(xì)胞數(shù)目為20:1的比例加入輔助噬菌體后繼續(xù)37℃培養(yǎng)30分鐘。加入終濃度為50µg/mL的Kana和終濃度為0.2mMI PTG，30℃過夜搖床培養(yǎng)。
6.6.2噬菌體文庫制備
將過夜培養(yǎng)的細(xì)菌4℃ 4000 rpm離心20分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到新的離心管后加入1/4體積預(yù)冷的的20％PEG/2.5M NaCl，在冰上孵育30分鐘。4℃ 4000 rpm離心20分鐘去除上清后加入1 mL PBS緩沖液溶解沉淀。再次加入1/4 體積預(yù)冷的20％PEG/2.5M NaCl后冰上孵育10分鐘，4℃ 12000 xg離心10分鐘后去除上清并將沉淀溶解在1 mL PBS中得到噬菌體庫，長期-80℃保存，短期（1-2周）可于4℃放置保存。
6.7噬菌體文庫效價檢測
將-80℃冰箱保存的 SS320 菌株培養(yǎng)后，從單菌落板上挑取一個單菌落到 5ml  2×YT 培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，過夜培養(yǎng)菌液OD600 為 0.5-0.55。取制備好的噬菌體文庫稀釋12個梯度，每個梯度加入90μl 的 SS320 菌液培養(yǎng)，每個稀釋管取5μl加到2×YT 固體培養(yǎng)基（Amp）過夜培養(yǎng)，即可計算效價。