如何零基礎開展多重熒光免疫檢測業(yè)務？-系列1
1. 病理醫(yī)生在開發(fā)一個mIF/IHC套餐中（panel）能其什么作用？
病理醫(yī)生應參與mIF/IHC套餐開發(fā)過程中的每個步驟，從panel設計到最終質量控制（QC）。病理醫(yī)生需要為組織樣本的生物標記物選擇、驗證、試驗方法、質量控制等問題提供科學和臨床指導。病理醫(yī)生也需要解釋數據。任何mIF/IHC成功開發(fā)都取決于病理醫(yī)生、項目技術人員和免疫科學家之間的成功合作，經常還需要免疫治療藥物廠家的支持。
2. 我們應該開展mIF/IHC業(yè)務嗎？主要的決定因素應該是你們業(yè)務發(fā)展的需要，尤其是你們醫(yī)院的臨床是否需要，要考慮這項業(yè)務的開展會給臨床醫(yī)生和患者帶來那些收益。然后可能要考慮的是科學問題，開展這項業(yè)務可能會給醫(yī)學科學研究帶來那些新發(fā)現(xiàn)。另外，也要考慮樣本可用性。由于mIF/IHC套餐設計和驗證比傳統(tǒng)的單IHC要求更高，因此只有在傳統(tǒng)的單一IHC分析無法回答我們的科學研究和解決臨床問題時才應使用mIF/IHC套餐。例如，如果所需數據僅限于整個切片或區(qū)域層面上多個抗體標記的豐度，并且使用多個切片的單一IHC就夠用了。然而，如果所需數據要求包括同一細胞的多個標記物的共定位、不同表型的單個細胞之間的鄰近距離測量及其相對空間分布，mIF/IHC的信息量更大。最后，如果樣品珍貴或難以獲取，也有必要轉向開發(fā)mIF/IHC解決方案。
3. 我們實驗室已經在平時的常規(guī)IHC診斷工作驗證了許多傳統(tǒng)的單一IHC方法。我們能利用已經驗證的多個單一IHC檢測方法學來快速開發(fā)一個的mIF/IHC套餐嗎？有多種方法可以利用已開發(fā)的單一 IHC來指導多重免疫組化mIF/IHC的開發(fā)。
最簡單的方法是開發(fā)一種傳統(tǒng)單IHC的循環(huán)染色方法，就是依次進行抗體染色-全玻片掃描-抗體剝離/去除的循環(huán)，然后融合和對齊每個循環(huán)采集的全切片圖像。但這種方法很耗時耗力，因為每個抗體是串聯(lián)線性加入，而且目前是手動操作。
更好的選擇是選擇一種mIF/IHC染色系統(tǒng)，使用與單IHC相同的一抗，經常一抗是未標記的。這使得相同的一抗結合條件（阻斷、濃度、稀釋劑、溫度和時間）可以在做mIF/IHC時重現(xiàn)。如果一抗直接用DNA barcode、半抗原或酶標記，則應重新確定或至少確認結合條件，因為一抗被改變了。一旦敏感性和特異性確定沒問題了，一抗應用條件應保持不變。其他考慮因素包括一抗染色順序、熒光標記選擇和其濃度和重復性測試。盡管有額外的步驟要做，但這是將傳統(tǒng)的單IHC檢測信息應用于mIF/IHC套餐的最佳方法。
4. 病理醫(yī)生因為傳統(tǒng)IHC使用顯色染色而不是熒光染色，往往對熒光圖像水土不服、比較排斥，如何促進他們對這些新技術的興趣？病理醫(yī)生對熒光的抗拒部分原因是缺乏免疫熒光染色經驗和缺乏時間學習。不幸的是，mIF/IHC的復雜性在兩方面增加了時間需求。首先，與光學顯微鏡的傳統(tǒng)識別模式不同，多個生物標記物數據需要在多個熒光通道之間來回切換。其次，數字化也有一個習慣過程，也是病理醫(yī)生面臨的一個挑戰(zhàn)，他們更習慣于使用手動、普通光學顯微鏡讀片。病理醫(yī)生在平時的顯色IHC工作中習慣于將顯色分級為陽性1-3+，但免疫熒光染色具有更大的線性動態(tài)范圍（意味著更精準的定量分析），病理醫(yī)生往往對此缺乏經驗。不過，通過適當的培訓、數據支持的標準閾值方法以及在病理醫(yī)生中開展這項新技術好處的教育，病理醫(yī)生可以很快適應mIF/IHC。一旦適應，與單IHC相比，他們會發(fā)現(xiàn)這項新技術是幫助他們解決臨床診斷工作的強大工具。此外，許多數字病理分析程序現(xiàn)在提供了偽彩色選項，可以通過單獨顯示每個標記（或其任何組合，如綠色+紅色信號=黃色信號）來方便新用戶，就像它們在標準數字病理（甚至傳統(tǒng)顯微鏡）圖像中出現(xiàn)一樣。
5. 我們知道，傳統(tǒng)上，病理醫(yī)生一直以來的讀片診斷工作是一種基于經驗的定性診斷，病理醫(yī)生對使用軟件進行量化分析往往感到不舒服，這種情況有什么建議？與視野下的感興趣區(qū)域（ROI）相比，病理醫(yī)生應用虛擬切片圖像的可視化技術（WSI）進行診斷、分級、評分，病理醫(yī)生基本都此認可和滿意，特別是如果能夠生成偽彩單一IHC染色的 WSI（見圖1）。大多數病理醫(yī)生應該能夠通過單獨顯示每個標記物染色或一一組合來手動為mIF/IHC 的WSI評分，就像標準數字病理學解決方案一樣。這會是一個很好的過渡或適應過程，讓病理醫(yī)生慢慢適應熒光染色、尤其是多種熒光染色，并慢慢了解多重染色的好處和強大。
圖1.使用mIF/IHC對正常肝組織的代表性染色圖像，及其仿IHC的偽彩圖像A. mIF/IHC染色：DAPI（藍色）、CD3（綠色）、泛細胞角蛋白（紅色）；B．偽彩IHC：DAPI（藍色），泛細胞角蛋白（棕色）；C. 偽彩IHC：DAPI（藍色），CD3（棕色）；D. 偽彩IHC DAPI（藍色），放大倍數均為：200倍。
6.開展mIF/IHC工作是否需要暗室？不需要，可以在標準的病理實驗室中進行。使用暗室是選項而非必須的。
7. mIF/IHC的組織厚度是否有特殊考慮？適當的組織厚度是高質量mIF/IHC圖像的關鍵。適合于mIF/IHC分析的FFPE組織厚度應在4–5μm，通常為一個細胞厚。某些組織類型有不同的切片厚度考慮，例如，大腦和中樞神經系統(tǒng)（CNS）組織切片需要8-10μm厚度來顯示神經元。另一方面，在組織樣本有限的情況下，如穿刺活檢或淋巴結，3μm是可以接受的，但小于2μm的厚度有可能導致不準確的結果。
8. 可以使用現(xiàn)有傳統(tǒng)的單一IHC流程進行mIF/IHC組織處理、切片和染色嗎？單一IHC和mIF/IHC的組織處理和切片應在相同條件下進行。mIF/IHC套餐的優(yōu)化和驗證按以下順序進行：i）傳統(tǒng)單一IHC；ii）單一IF(單一免疫熒光)；和iii）mIF檢測。這些染色都應在連續(xù)的組織切片中進行。經驗表明，將傳統(tǒng)的單一IHC染色轉化為mIF染色方案往往都要改變一些東西，例如改變信號檢測系統(tǒng)，從而使單一IHC和mIF/IHC兩種檢測之間獲得相同的信號強度⑵。
9.每次染色應處理哪些對照品？每次染色應進行三個主要對照：
第一個是陽性對照組，它應該代表待檢測組織特征。這有助于確定自動染色機是否正確加樣了所有試劑，還可以在成像后標準化以減少批次效應，作為標準化一部分。
第二個是同型或特異性對照。所有一抗應替換為非特異性抗體，以顯示染色方法中的非一抗試劑對每個通道中觀察到的信號的貢獻程度。
三是自熒光控制。在不使用任何熒光試劑的情況下揭示組織中的整體自熒光、以及所有試劑的熒光狀態(tài)，這些試劑不應該直接影響每個通道中的熒光信號。
10. 冷凍樣品能否用于mIF/IHC？mIF/IHC通常不在冷凍樣本上進行，因為組織結構在新鮮冷凍組織中的保存不如FFPE樣本。大腦和中樞神經系統(tǒng)的小鼠研究除外，這些研究主要在切割8-10μm厚的冷凍組織中進行。當然，也有在冷凍樣本做mIF/IHC的報道。
11.對于具有挑戰(zhàn)性的樣本類型有哪些特殊考慮？骨和中樞神經系統(tǒng)等組織傾向于顯示高背景染色，這可能會對某些標記物的特異性和非特異性染色信號分離形成挑戰(zhàn)。使用較薄的切片、優(yōu)化包被、阻斷步驟和使用單克隆一抗等，可以減少高背景的可能性。使用選擇性抗體稀釋液和包被、封閉試劑可以進一步顯著降低背景并增強染色強度。
此外，由于高水平的脂褐素，中樞神經系統(tǒng)組織可呈現(xiàn)較高水平的自體熒光。在蘇丹紅或脂褐素淬滅劑溶液中孵育載玻片有助于緩解這一問題，這些溶液也有助于減少骨髓中的免疫熒光背景染色。自熒光還可以利用多光譜成像和光譜拆解技術進一步解決，允許將自體熒光分離到一個離散通道和每個檢測生物標記物通道，而不用考慮熒光強度或光譜重疊，從而提供準確的檢測數據和定量信息。
12.如何儲存切片和組織塊最有利于mIF/IHC？雖然組織可以以不同的方式保存，但FFPE是醫(yī)院和研究中心保存臨床樣本的主要方法。病理行業(yè)在福爾馬林固定和對FFPE組織中生物分子降解的理解確實有爭議。
行業(yè)共識是儲存載玻片在室溫干燥環(huán)境下，組織塊也是在室溫干燥環(huán)境下，將其保存在石蠟塊中（理想情況下，切割表面覆蓋一層石蠟層，以避免組織氧化），并防止光照。保存完好的組織塊可成功保存長達10年。此后，可能會發(fā)生明顯的組織降解，因此在開始任何有關mIF/IHC的回顧性研究之前，應確認10年以上組織塊的形態(tài)質量（通過H&E）和其抗原性。
盡管載玻片儲存方案也存在爭議，但共識是使用新切的組織切片，將其4°C儲存在載玻片盒內。有些人建議將切好的組織切片存放在干燥的氮氣室中（以避免組織氧化），但并非所有實驗室都配備氮氣室。三個月后，某些標記物的抗原表位會喪失，因此，mIF/IHC的最佳實踐是使用不到三個月的切片。
13.在一個通道中混合兩個標記是否可行且有用？可行，在mIF/IHC中實踐中還是傾向于不混用，混合應用往往見于下面這種情況：將多個腫瘤/癌癥標記物混合到一個通道中，例如，泛細胞角蛋白（pan-cytokeratin）和任何其他細胞角蛋白（如肝臟樣本中的CK18），用于確認或排除組織的上皮性質。
14. 合理的mIF/IHC套餐內應該包括多少種生物標志物？套餐中待檢測標志物的數量取決于技術平臺和目標。臨床應用及臨床研究而言，更多并不一定更好。常常，一個包含三個生物標志物的套餐就足夠了，例如，泛細胞角蛋白（pan-cytokeratin）、CD45和PD-L1的三重染色就能滿足對PD-L1表達的評分⑶。對于一個探索性研究，往往需要更多的生物標志物來發(fā)現(xiàn)表達譜，可以考慮使用具有大規(guī)模能力的多重熒光染色平臺，使用包含較多生物標志物的大套餐。
15.如何組合、匹配一個mIF/IHC套餐里面各個熒光標記？匹配標記、染色化學和成像平臺的一些策略是什么？目標生物標記物的性質、可用的抗體以及熒光標記是主要決定因素⑷。靶生物標記物的表達模式（核、細胞質或膜）、表達豐度（少數至數百個細胞）和每個細胞內的表達水平，以及在非靶細胞中的表達，都是重要的因素。
檢測系統(tǒng)、一抗和二抗以及選擇的熒光標記分子對于確定最終結果的特異性（信噪比）至關重要。由于最終熒光標記的熒光強度由其發(fā)射光強度決定的，經驗是將弱熒光標記與豐富或強烈的生物標記物相匹配。
其他決定因素包括先前的優(yōu)化過程、正確的抗體和熒光抗體濃度。
16.切片染色后成像時，如何檢測到批次效應并減輕它？原始圖像中的批處理效應（設置優(yōu)化后由掃描儀直接生成的批處理效應）由設置的更改或掃描儀的機械特性，例如光源、載物臺和校準、載玻片/蓋玻片厚度和其他變量決定。檢測這些細微差別和批量效應通常需要有經驗的技術人員或病理醫(yī)生提供線索，他們對QA/QC過程的監(jiān)督對于解決此階段的批處理效果至關重要，因為原始圖像決定了要生成的下一批圖像（次圖像）。
次圖像通�；趨⒖紟旌筒鸾馑惴ㄉ伞Ｓ捎诓Ｆg的不一致或不正常染色，此類方法可能會出現(xiàn)批錯誤，因此正確的染色是關鍵�；诟鞣N熒光標記的豐度和分布的染色變化也可能使算法發(fā)生偏差，使其成為批錯誤的潛在來源。畢竟，算法取決于輸入的圖像和參考庫，無論是合成的還是測量的。
類似地，在對算法進行訓練以執(zhí)行圖像分割和評分之后，在圖像分析期間也可能會出現(xiàn)批處理效應問題。這涉及到上述所有要點，及人工智能（AI）準確分割和評分的能力。因此，批量效應必須由訓練有素的科學家和病理醫(yī)生團隊進行QA/QC，以確定其影響并避免數據報告中出現(xiàn)較大精度錯誤。
17.可以從現(xiàn)有的、經過驗證的流式細胞儀套餐（抗體panel）構建mIF/IHC套餐嗎？可能的，然而，大多數流式細胞儀中使用的抗體與IHC（組織中含石蠟）不相容，很可能是因為細胞懸浮液中抗原的表位呈現(xiàn)可能與IHC組織切片中細胞的抗原的表位或抗原決定簇不同。
在流式細胞術中，熒光標記通常直接與一抗結合。相反，大多數IHC和mIF/IHC方法使用二抗間接標記法，因為往往需要二抗進行信號放大。流式細胞儀抗體在流式細胞術應用中有良好信噪比，但應用于mIF/IHC可能是很大的挑戰(zhàn)，因為對于含量較低或表達較弱的蛋白質，信號可能較弱或檢測不到。
流式細胞儀和IHC科學家對細胞表型檢測也可能有不同的觀點。例如，IHC科學家可能只使用FOXP3抗體來鑒定調節(jié)性T細胞，而flow科學家通常還包括譜系標記。在將流式細胞儀的抗體panel轉換為mIF/IHC套餐之前，建議進行文獻回顧并咨詢免疫學家和病理學家。
18.是否需要特定設備來實現(xiàn)多重免疫熒光染色？擁有熒光數字病理掃描儀是否就足夠？這取決于檢測目標的數量。通過熒光掃描儀，大部分病理實驗室配備可以輕松實現(xiàn)四重或四色mIF/IHC。一些熒光掃描儀可以調整以檢測多達六個標記。對于超過七種顏色的可視化，建議使用多光譜熒光掃描儀，但不是“必備品”。
19.高效分析mIF/IHC需要考慮哪些因素？組織微陣列（TMA）是進行mIF/IHC最具成本效益的方法。然而，即使TMA是由病理醫(yī)生構建的，經過幾次切片后，TMA組織的形態(tài)和成分也會發(fā)生變化。建議在開始mIF/IHC項目之前先進行H&E染色，以確保TMA仍然適用。
在資源相對有限的環(huán)境下，mIF/IHC的WSI全切片分析——將是接近實際病理診斷的理想方式。但是，必須小心區(qū)分“全切片分析”和“全切片檢查”。病理醫(yī)生確實需要檢查整個切片，但不需要量化整個切片。即使關注點在腫瘤區(qū)域，生物標記物也往往只在熱點區(qū)域計分或打分。將正確答案——以及正確的科學問題——置于正確的環(huán)境中是取得成功的關鍵。
目前基于熒光標記的多重熒光組織免疫mIF/mIHC是探測腫瘤微環(huán)境應用最廣泛的技術，TLR專注于mIF/mIHC的相關技術，致力于將免疫染色（mIF/mIHC）、熒光圖像采集和分析的自動化和智能化，研發(fā)用于mIF/mIHC的全自動免疫組化染色機（TR-Stainer） 和熒光全切片掃描儀，其中TR-sWSI-5F熒光掃描儀具備快速5色掃描功能（藍色DAPI、綠色FITC、黃色TRITC、紅色Cy5、近紅外Cy7），滿足目前免疫熒光組化的絕大多數臨床需求。而TR-sWSI-MF 的多光譜熒光掃描儀（（定制化））可以將多達15種顏色和自體熒光彼此得到很好的分離，從而使用戶信心百倍地專注于量化真正發(fā)生的生物學相互作用，能夠在整個切片上同時觀察和測量組織的細胞，包括多種細胞表型。
