細(xì)胞培養(yǎng)中“胰蛋白酶” 和 “膠原蛋白酶”的不同作用機(jī)制及適用情況

在進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，首先要對(duì)新鮮取材的動(dòng)物組織等進(jìn)行處理，或用機(jī)械的方法，或用胰蛋白酶、膠原蛋白酶等處理一段時(shí)間，將組織分散成單個(gè)細(xì)胞即原代培養(yǎng)。在進(jìn)行傳代培養(yǎng)時(shí)，貼壁細(xì)胞需要重新用胰蛋白酶等處理，使之分散成單個(gè)的細(xì)胞。那么“胰蛋白酶”和“膠原蛋白酶”到底有什么區(qū)別呢？我們?cè)诩?xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)該如何選擇？
 

盡管胰蛋白酶和膠原蛋白酶都是細(xì)胞培養(yǎng)中常用于將體積較小的組織塊分散成細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞的消化液，但它們的作用機(jī)制及適用情況并不相同。
 

一、胰蛋白酶的作用特點(diǎn)

胰蛋白酶分離自牛、豬等動(dòng)物的胰，作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽鏈，除去細(xì)胞間黏蛋白及糖蛋白，從而使細(xì)胞分離，是應(yīng)用廣泛的消化物，適用于消化細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織，如胚胎組織、羊膜、上皮組織、肝、腎等軟組織以及傳代細(xì)胞等。胰蛋白酶的消化作用與酶的濃度、pH、溫度、組織塊的大小以及組織的硬度都有關(guān)系。胰蛋白酶濃度過大或消化時(shí)間太長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞被消化；但反之消化不充分也達(dá)不到分散細(xì)胞的目的。此外，血清明顯抑制胰蛋白酶的活性，Ca2+和Mg2+對(duì)胰蛋白酶的活性有一定抑制作用。
 

根據(jù)細(xì)胞類型和實(shí)驗(yàn)?zāi)康�，可選用含/不含EDTA或酚紅的胰蛋白酶，其作用如下：
 

EDTA（乙二胺四乙酸）：胰蛋白酶中的EDTA主要起到螯合金屬離子，使細(xì)胞更容易分散的作用。 EDTA可以螯合Ca2+ 或Mg2+，而細(xì)胞表面很多和培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶結(jié)合的蛋白都是帶有Ca2+ 或Mg2+的，把這些離子螯合后，可以加速細(xì)胞和培養(yǎng)皿的脫離，促進(jìn)消化。EDTA是2價(jià)陽(yáng)離子螯合劑，所以能螯合鈣、鎂等離子。上皮類細(xì)胞的連接存在“橋粒”結(jié)構(gòu)，是細(xì)胞間最“牢固”的連接，但橋粒的形成依賴于鈣離子的存在。在胰酶消化細(xì)胞時(shí)，加入EDTA，可以破壞細(xì)胞的橋粒結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞能夠分散成單個(gè)細(xì)胞。通俗地說，就是破壞細(xì)胞間的粘連。
 

酚紅：胰蛋白酶中的酚紅主要是起到PH指示劑的作用。胰蛋白酶的最佳活性在7至9的pH范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)。在此范圍內(nèi)的酚紅呈粉紅色。由于環(huán)境條件，胰蛋白酶的pH可能變?yōu)樗嵝�，呈橙色并使胰蛋白酶的效果降低。使用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.4-7.6可以優(yōu)化胰蛋白酶活性。研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用（特別是雌激素）。為避免固醇類反應(yīng)，培養(yǎng)細(xì)胞尤其是哺乳類細(xì)胞時(shí)，用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測(cè)，一些研究人員在做流式細(xì)胞檢測(cè)時(shí)，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。
 

濃度：一般常用胰酶的工作濃度為0.25%，而半貼壁細(xì)胞或?qū)σ让该舾械募?xì)胞常采用低濃度（0.05%）的胰酶進(jìn)行細(xì)胞消化。
 

貼壁細(xì)胞消化實(shí)驗(yàn)方案

（1）吸去培養(yǎng)液，用無菌的PBS、Hanks液或無血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞一次，以去除殘余的血清。

（2）加入少量胰蛋白酶消化液，蓋過細(xì)胞即可，室溫放置1-2分鐘。不同的細(xì)胞消化時(shí)間有所不同，對(duì)于貼壁牢固的細(xì)胞可適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間。

（3）顯微鏡下觀察，細(xì)胞明顯收縮，并且肉眼觀察培養(yǎng)器皿底部發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生明顯的變化；或者用槍吹打細(xì)胞發(fā)現(xiàn)細(xì)胞剛好可以被吹打下來。此時(shí)吸除消化液。加入含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，吹打下細(xì)胞，即可直接用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

（4）如果發(fā)現(xiàn)消化不足，可加入胰蛋白酶消化液重新消化。

（5）如果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞消化時(shí)間過長(zhǎng)，未及時(shí)吹打細(xì)胞，細(xì)胞已經(jīng)有部分直接從培養(yǎng)器皿底部脫落，直接用胰酶細(xì)胞培養(yǎng)液把細(xì)胞全部吹打下來。1000-2000g離心1分鐘，沉淀細(xì)胞，盡量去除胰酶細(xì)胞消化液后，加入含血清的完全培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞，即可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

組織的消化：不同的組織需要消化的時(shí)間相差很大，通常以消化后可以充分打散組織為宜。

二、膠原蛋白酶的作用特點(diǎn)

膠原蛋白酶是能在一定的pH和溫度下切割膠原蛋白主體螺旋多肽鏈的酶類，主要用于水解結(jié)締組織中的膠原蛋白，適于消化纖維性組織、上皮組織以及癌組織等。當(dāng)擬消化的組織較硬，內(nèi)含較多的結(jié)締組織或膠原成分時(shí)，用胰蛋白酶解離細(xì)胞效果較差，可采用膠原酶解離細(xì)胞法。鈣、鎂離子以及血清不會(huì)影響膠原酶的消化作用，其消化作用緩和，且無需機(jī)械振蕩。
 

目前商業(yè)化的膠原酶因所含組分的差異分為五類，其在應(yīng)用上具有一定區(qū)分：

（1）膠原酶Ⅰ型：含有比較均勻的各種酶活力（包括膠原酶、酪蛋白酶、梭菌蛋白酶、胰蛋白酶活性），通常用作上皮細(xì)胞、肝、肺、脂肪和腎上腺組織細(xì)胞的制備。

（2）膠原酶Ⅱ型：比I型膠原酶含更高的梭菌蛋白酶活性，通常用作心臟、骨、肝、甲狀腺、唾液腺和軟骨等組織的原代細(xì)胞制備。

（3）膠原酶Ⅲ型：含較低的次級(jí)蛋白酶污染物水解活性，但具典型的膠原酶活性。常用于乳腺組織的原代細(xì)胞制備。

（4）膠原酶Ⅳ型：含較低的胰酶活性以降低對(duì)膜蛋白和受體的損害，通常用于胰島細(xì)胞制備，和維持受體完整性比較重要的其他研究，也可用于髓系細(xì)胞制備。

（5）膠原酶V型：含更高的膠原酶和酪蛋白活性，更低胰酶水平以降低對(duì)膜蛋白和受體造成損傷。適用于胰島制備。