etOPTIMUS轉(zhuǎn)染試劑在干細(xì)胞轉(zhuǎn)染中效率表現(xiàn)和應(yīng)用

干細(xì)胞被認(rèn)為是可用于建模和修復(fù)細(xì)胞功能的最強(qiáng)大和最靈活的細(xì)胞類型。目前干細(xì)胞被廣泛用于藥物篩選、細(xì)胞治療、疾病建模、毒理學(xué)和基因組編輯研究，可以說幾乎用于任何基礎(chǔ)和轉(zhuǎn)化研究領(lǐng)域。重要的是，其中許多技術(shù)依賴于將基因和/或蛋白質(zhì)成功引入干細(xì)胞，例如CRISPR/Cas9基因編輯。然而，干細(xì)胞，特別是多能干細(xì)胞（即能夠產(chǎn)生任何體細(xì)胞類型的細(xì)胞）特別難以轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染干細(xì)胞時最大的挑戰(zhàn)是細(xì)胞死亡，這在非病毒和病毒轉(zhuǎn)染遞送方法之后都有報道。此外，由于對細(xì)胞死亡的易感性和快速自我更新，干細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率可能低于其他細(xì)胞類型。

為了利用基于化學(xué)轉(zhuǎn)染進(jìn)行基因操作的優(yōu)勢，理想的試劑需要實現(xiàn)高轉(zhuǎn)染效率（在干細(xì)胞高于50%的情況下），同時最大限度地減少常見的干細(xì)胞細(xì)胞活力問題。

在此，本文報道了基于化學(xué)轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)染試劑jetOPTIMUS®在三種難轉(zhuǎn)染的干細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率的表現(xiàn)：間充質(zhì)干細(xì)胞（hMSCs）、小鼠胚胎干細(xì)胞（mESCs）和人類誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞(hiPSCs)。JetOPTIMUS®基于陽離子聚合物，在各種原代細(xì)胞中達(dá)到DNA的高轉(zhuǎn)染效率，同時對細(xì)胞活率和形態(tài)的影響最小。此外，還評估了jetOPTIMUS對幾種市售和常用的培養(yǎng)物和底物系統(tǒng)上培養(yǎng)hPSCs的轉(zhuǎn)染效率。

結(jié)果與討論

1.jetOPTIMUS®確保原代間充質(zhì)干細(xì)胞在多次傳代時具有高轉(zhuǎn)染效率
 

圖1：在用jetOPTIMUS®轉(zhuǎn)染eGFP質(zhì)粒24小時后，通過流式細(xì)胞術(shù)分析評估轉(zhuǎn)染效率，該質(zhì)粒在培養(yǎng)四個后續(xù)傳代的原代人間充質(zhì)干細(xì)胞（hMSC）中。

2.jetOPTIMUS®在不影響小鼠胚胎干細(xì)胞生存能力的情況下實現(xiàn)了60%以上的轉(zhuǎn)染效率
 

圖2A：在原代mESCs中用jetOPTIMUS®轉(zhuǎn)染eGFP質(zhì)粒24小時后，通過流式細(xì)胞術(shù)分析評估轉(zhuǎn)染效率。

圖2B：在原代mESCs中用jetOPTIMUS®轉(zhuǎn)染eGFP質(zhì)粒24小時后，通過流式細(xì)胞術(shù)評估細(xì)胞活力。

3.jetOPTIMUS®在hiPSC中提供高達(dá)80%的轉(zhuǎn)染效率
 

圖3 A：用jetOPTIMUS®在hiPSC中轉(zhuǎn)染eGFP質(zhì)粒24小時后，通過流式細(xì)胞術(shù)分析評估轉(zhuǎn)染效率。

圖3B：用eGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24小時的hPSCs中的GFP表達(dá)和相應(yīng)的相位圖像。

4.評估jetOPTIMUS®搭配幾種hiPSC培養(yǎng)基和底物的轉(zhuǎn)染效率
 

表1A：jetOPTIMUS®在用幾種商業(yè)干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)的hiPSC中的轉(zhuǎn)染效率從最高到最低。

表1B：jetOPTIMUS®在用幾種商業(yè)干細(xì)胞基質(zhì)培養(yǎng)的hiPSC中的轉(zhuǎn)染效率從最高到最低。

轉(zhuǎn)染方法：

質(zhì)粒pCMV_eGFP_Luc（6.4kb）編碼具有巨細(xì)胞病毒（CMV）啟動子的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（eGFP）/螢光素酶的融合蛋白，購自Clontech（#6169-1）。質(zhì)粒pEF1a_eGFP（4.9kb）編碼具有延伸因子-1α（EF1a）啟動子的eGFP，購自Ezyvec（#A626.1）。pCMV_eGFP_Luc用于轉(zhuǎn)染hMSC和mES，pEF1a_eGFP用于轉(zhuǎn)染hiPSC。

轉(zhuǎn)染前72小時，將hMSCs接種在24孔板中，每孔12000個細(xì)胞，接種在500µL相應(yīng)的細(xì)胞維持培養(yǎng)基中，并在37°C下用5%CO2孵育。對于mESCs，在轉(zhuǎn)染前24小時，將細(xì)胞以每孔20000個細(xì)胞的速度接種在500µL mES培養(yǎng)基中的24孔板中，并在37°C下用5%CO2孵育。對于hiPSC，在轉(zhuǎn)染前24小時，將細(xì)胞接種在涂有Corning®Matrigel®基質(zhì)的24孔板中，該基質(zhì)含有2 mL mTeSR培養(yǎng)基和10µM ROCK抑制劑，每孔10萬個細(xì)胞，并在37°C和5%CO2下孵育。

對于hMSCs和hiPCS，在轉(zhuǎn)染前30分鐘，移除培養(yǎng)基并用500µL的MSCBM代替™，不添加補(bǔ)充物，或分別用500µL含有10µM ROCK抑制劑的hiPSCs培養(yǎng)基，將培養(yǎng)板放回培養(yǎng)箱。