論單通道檢測(cè)在發(fā)酵尾氣分析中的應(yīng)用
論文已發(fā)表在《發(fā)酵科技通訊》2022年4期
由圖 1 可知：在臨界點(diǎn)改變攪拌轉(zhuǎn)速后，細(xì)胞快 速進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 。 實(shí)驗(yàn)中根據(jù)臨界點(diǎn)及曲線變化 趨 勢(shì)，恰 當(dāng) 掌握攪拌轉(zhuǎn)速 調(diào) 整時(shí)機(jī)，滿 足 供 氧 需 求，使植酸酶表達(dá)量及酶活均達(dá)較高水平 。
2．2．2 利用臨界點(diǎn)進(jìn)行補(bǔ)料
流加補(bǔ)料－分 批 發(fā) 酵[19－23] 是現(xiàn)代發(fā)酵工 程 普 遍 采用的方式，可以較好地解決底物阻遏，按設(shè)備能力 供氧，減緩代謝有害物的不利影響；尤其對(duì)于基因工 程菌高密度發(fā)酵，流加補(bǔ)料是實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵必不 可少的手段 。流加補(bǔ)料技術(shù)的關(guān)鍵是對(duì)補(bǔ)料時(shí)機(jī)的 把握，利用發(fā)酵尾 氣分析曲線中的臨界點(diǎn)能夠比較 精準(zhǔn)地掌控補(bǔ)料時(shí)機(jī) 。
某大型藥企在重 組 大 腸 桿 菌培養(yǎng)白細(xì) 胞 介 素－ Ⅱ 生產(chǎn)過(guò)程中，在 1t 生產(chǎn)罐上應(yīng)用 FGA 發(fā)酵尾 氣 分析儀，監(jiān)測(cè)尾 氣 變 化，其 發(fā) 酵 過(guò) 程 CER 曲 線 如 圖 2 所 示 。 由 圖 2 可 以 看 出 CO2 的 整 體 變 化 規(guī) 律： 1) 發(fā)酵開(kāi) 始 后，CER 先 有 極 短 的 平 緩 區(qū)，很 快 在 1h32min時(shí)曲線 出 現(xiàn) 快 速 上 升 的 臨 界 點(diǎn)，預(yù) 示 重 組大腸桿菌生長(zhǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，此時(shí)開(kāi)始流加補(bǔ) 料，并根據(jù) DO反饋值調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速，保 持 DO 在 較 高水平 。2) 在 CER迅速上升的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，逐漸提 高流加補(bǔ)料速率，在達(dá)到峰值，出現(xiàn)臨界點(diǎn)時(shí)，流加速 率達(dá)到最大 。3) 在 發(fā) 酵 后 期，補(bǔ) 料 速 率 維 持 在 某 一 穩(wěn)定水平，直至發(fā)酵結(jié) 束 。整 個(gè) 發(fā) 酵 過(guò) 程 約 10h，產(chǎn) 物表達(dá)量 占 菌 體 總 蛋 白 的 40％ 。 發(fā) 酵 過(guò) 程 中 對(duì) 數(shù) 生長(zhǎng)期起點(diǎn)和終點(diǎn)(臨界 點(diǎn)) 的 出 現(xiàn) 都 發(fā) 生 在 1 min 內(nèi)，如非采用實(shí)時(shí)連續(xù)在線檢測(cè)是難以觀察到的 。
2．3 利用臨界點(diǎn)進(jìn)行誘導(dǎo)
在重組大 腸 桿 菌 發(fā) 酵 過(guò) 程 中，通 常 采 用 IPTG 誘導(dǎo)劑進(jìn) 行 誘 導(dǎo) 。 IPTG 誘 導(dǎo) 劑 具 有 一 定 毒 性，對(duì)宿主和代謝產(chǎn)物有抑制作用，且 費(fèi) 用 高 昂，在 工 業(yè) 化 大規(guī)模生產(chǎn)中較難推廣 。乳糖是一種廉價(jià)資源，可以 作為碳源被大腸桿菌代謝利用，有報(bào)道在重組蛋白培養(yǎng)中用其作誘導(dǎo)劑，但尚不普遍，究其原因，除誘導(dǎo)機(jī) 理復(fù)雜外，乳糖誘導(dǎo)時(shí)機(jī)不易把握也是重要因素 。
張毅 等[24] 在 LB 培 養(yǎng) 基 中，分 別 在 對(duì) 數(shù) 生 長(zhǎng) 期 的早 期 、中 期 以 及 后 期 對(duì) 融 合 蛋 白 表 達(dá) 菌 BL21 (DE3)(pFu) 進(jìn)行 乳 糖 誘 導(dǎo)，發(fā) 現(xiàn)：乳糖的加入會(huì)造 成菌體生長(zhǎng)遲滯，在 早 期 、中 期 進(jìn) 行誘導(dǎo)均不理想， 只有在后期進(jìn)行誘 導(dǎo) 效 果 最 佳，此 時(shí)既可以得到較 高的表達(dá)產(chǎn)物，又可以獲得較高 的 菌 體 密度 。 有 研 究報(bào)道[22－30] 表明：在培養(yǎng)基葡萄糖剛剛耗盡，細(xì)胞濃 度增加緩慢或略有下降時(shí)開(kāi)始誘導(dǎo)，效果最佳 。
應(yīng) 用 發(fā) 酵 尾 氣 分 析 技 術(shù)，可 以 直 觀 地 辨 識(shí) 菌 體 生長(zhǎng)的各個(gè)階 段 。 一般在對(duì) 數(shù)生長(zhǎng)期的后期，即 培 養(yǎng)基中葡萄糖剛剛 耗 盡，細(xì)胞濃度增加緩慢或略有 下降時(shí)，尾氣分析的 CER 曲線會(huì)出現(xiàn)一個(gè)由上升轉(zhuǎn) 為下降的臨界點(diǎn)，利用該臨界點(diǎn)可 以方便地確定誘 導(dǎo)時(shí)機(jī)，及時(shí)進(jìn)行乳糖誘導(dǎo) 。
2．2．4 利用臨界點(diǎn)處理異常發(fā)酵
雖然微生物發(fā)酵是一個(gè)非線性時(shí)變系統(tǒng)，包含了 生物、化學(xué)及物理的各種變化，過(guò)程較為復(fù)雜，但是當(dāng) 各 種 條 件 固 定 后，微 生 物 細(xì) 胞 代 謝 又 遵 循 一 定 的 規(guī) 律 。從發(fā)酵尾氣分析得到的大量數(shù)據(jù)來(lái)看，在某種發(fā) 酵體系中，當(dāng)工藝條件確定后，其 分析曲線整體形態(tài) 是確定的，一旦發(fā)生改變，通常 預(yù) 示著某種代謝的改 變 。 因此，捕捉那些異 常 臨 界 點(diǎn)，對(duì)異常發(fā)酵的及早 發(fā)現(xiàn)和處理很有意義，特別是對(duì)工業(yè)大生產(chǎn)和高附加 值的生物制藥更是如此 。就此而言，尾氣分析的敏感 性和實(shí)用性均超過(guò)了 pH 、DO等其他現(xiàn)有檢測(cè)手段 。
在廣東某高校進(jìn)行的重組大腸桿菌發(fā)酵 藥 物 蛋 白實(shí)驗(yàn)中，發(fā)酵開(kāi)始后，經(jīng)過(guò)短暫的遲緩期，CO2 曲線 開(kāi)始緩慢上 升，約 2h 后 發(fā) 酵 快 速 進(jìn) 入 對(duì) 數(shù) 生 長(zhǎng) 期； 20min后，CO2 曲 線 突 然 出 現(xiàn) 了 下 折，CO2 體積分?jǐn)?shù) 迅速下降，在不到 30min 的時(shí)間內(nèi)下降到接種前水平， 鏡檢觀察，發(fā)現(xiàn)此時(shí)發(fā)酵液中的工程菌已經(jīng)消失，判斷 感染了噬菌體，隨即停止發(fā)酵，并迅速進(jìn)行滅菌處理。 該實(shí)驗(yàn)過(guò)程的 CO2 體積分?jǐn)?shù)變化曲線如圖 3 所示。
3 實(shí)時(shí)連續(xù)在線檢測(cè)
3．1 實(shí)時(shí)連續(xù)在線檢測(cè)的意義
利 用 發(fā) 酵 尾 氣 分 析 技 術(shù)，特 別 是 利 用 分 析 曲 線 上的臨界點(diǎn)，監(jiān)測(cè)發(fā)酵過(guò)程中細(xì)胞的代謝變化，可以 為發(fā)酵操作及進(jìn)一步工藝優(yōu)化提供 依 據(jù) 。 發(fā)酵尾氣 分析技術(shù)的關(guān)鍵在于對(duì)發(fā)酵過(guò)程中尾氣的 CO2 及 O2 進(jìn)行實(shí)時(shí)連續(xù)在線監(jiān)測(cè)，只有這樣才能捕捉到發(fā)酵狀 態(tài)改變的臨界點(diǎn)，監(jiān)測(cè)到細(xì)胞代謝狀態(tài)的改變 。 由于 發(fā)酵過(guò)程中臨界點(diǎn)的出現(xiàn)和狀態(tài)的改變往往 發(fā) 生 在 極短的時(shí)間內(nèi)，所以實(shí)時(shí)連續(xù)在線檢測(cè)尤為重要 。
3．2 采用單通道確保實(shí)時(shí)連續(xù)在線檢測(cè)
隨 著 現(xiàn) 代 科 技 的 發(fā) 展，發(fā) 酵 尾 氣 分 析 所 采 用 的 各檢測(cè)部件本身的響應(yīng)時(shí)間非常短，一般在毫秒級(jí)， 但從發(fā)酵罐排氣口到檢測(cè)腔，尾氣的傳輸需要時(shí)間， 相比之下檢測(cè)時(shí)間 可 忽 略 不 計(jì)，故完成一次檢測(cè)的 時(shí)間主要取決于尾氣的傳輸時(shí)間 。
雖然采用一套檢測(cè)部件加轉(zhuǎn)換開(kāi)關(guān)對(duì)多 套 發(fā) 酵 設(shè)備分時(shí)切換輪巡檢測(cè)的方式，可以實(shí)現(xiàn)一套尾氣分 析系統(tǒng)測(cè)定多點(diǎn)尾氣，降低發(fā) 酵 設(shè) 備 的 平 均 成 本，但 是在切換過(guò)程中，氣路轉(zhuǎn)換無(wú) 法 瞬 間 完 成，必 須 反 復(fù) 用后一通道的尾氣頂出前一通道的尾氣，會(huì)造成尾氣 混合帶來(lái)檢測(cè)誤差，此外還存 在 傳 輸 時(shí) 間 長(zhǎng) 、信 號(hào) 延 時(shí)等問(wèn)題，也增加了 染 菌 風(fēng) 險(xiǎn) 。 因 此，在 進(jìn) 行 發(fā) 酵 尾 氣分析檢測(cè)時(shí)，應(yīng) 該 采 用 獨(dú) 立 的 單 通 道 檢 測(cè)，即一套 檢測(cè)設(shè)備連接一個(gè)發(fā)酵罐，唯有采用此方式才可以實(shí) 現(xiàn)實(shí)時(shí)連續(xù)在線檢測(cè)，捕捉到那些極其重要的臨界點(diǎn)。
4 結(jié) 論
應(yīng)用發(fā)酵尾氣分析技術(shù)可以深入了解細(xì)胞的代 謝狀況 。分析曲線上的“臨界點(diǎn)”往往反映了發(fā)酵過(guò) 程狀態(tài)的改變，對(duì)研究發(fā) 酵工藝至關(guān)重要 。 要 捕 捉 這些臨界點(diǎn)就需要進(jìn)行實(shí)時(shí)連續(xù)在線檢測(cè)，唯 有 采 用獨(dú)立的單通 道檢測(cè)方能做到 。 目 前，發(fā) 酵 尾 氣 分 析技術(shù)日臻成熟，尾氣分析裝置也成為發(fā)酵罐的標(biāo) 準(zhǔn)配置 。 隨著設(shè)備的普及和尾氣分析在多方面應(yīng)用 的深入開(kāi)展，業(yè)界對(duì)其應(yīng)用效果的期望愈來(lái)愈高，單 通道檢測(cè) 在發(fā)酵尾氣分析中 的 意 義 會(huì) 日 益 清 晰 明 了，該檢測(cè)方式有望被業(yè)界廣泛接受 。
參考文獻(xiàn)：（略）
論單通道檢測(cè)在發(fā)酵尾氣分析中的應(yīng)用
公維麗1，2，劉仲匯1，2，馬耀宏1，2，史建國(guó)1，2
(1．齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院) 生物研究所，山東 濟(jì)南 250014；2．山東省生物傳感器重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250014)
摘要：發(fā)酵尾氣分析技術(shù)在業(yè)內(nèi)的應(yīng)用已逐漸展開(kāi)，但人們對(duì)單通道檢測(cè)的認(rèn)識(shí)依舊模糊 。從尾氣分析的意義、生物過(guò)程的“實(shí)時(shí)性”以及發(fā)酵過(guò)程的“臨界點(diǎn)”反映發(fā)酵狀態(tài)的改變等方面，闡述了發(fā) 酵尾氣分析應(yīng)采用實(shí)時(shí)、連續(xù)、在線檢測(cè)；通過(guò)以尾氣分析獲得的“臨界點(diǎn)”在發(fā)酵工程中的應(yīng)用(指 導(dǎo)轉(zhuǎn)速調(diào)整、流加補(bǔ)料、乳糖誘導(dǎo)及處理異常發(fā)酵)，進(jìn)一步闡明只有單通道檢測(cè)才能真正做到檢測(cè) 的實(shí)時(shí)、連續(xù)、在線，捕捉到有價(jià)值的“臨界點(diǎn)”信息。
關(guān)鍵詞：發(fā)酵；尾氣分析；單通道；檢測(cè)
中圖分類號(hào)：Q819 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1674－2214(2022)04－0217－05 DOI:10. 16774/j.cnki.issn. 1674-2214.2022.04.009
Discussion on the application ofsingle channel detection in fermentation tail gas
analysis
GONG Weili1，2， LIU Zhonghui1，2， MA Yaohong1，2， SHI Jianguo1，2
(1．Qilu University of Technology (Shandong Academy of Sciences)， Biology Institute，Jinan 250014， China；
2．Shandong Provincial Key Laboratory of Biosensors，Jinan 250014， China)
Abstract： The technology of fermentation tail gas analysis has been gradually developed and applied in the industry，but single－channel detection is still poorly understood．In this paper，we expounded that fermentation tail gas analysis should adopt real－time continuous online detection from the significance of fermentation tail gas analysis，the “real－time”of biological process，and the critical point of fermentation tail gas analysis curve reflecting the change information of process state，and the critical point obtained from tail gas analysis in fermentation engineering (guidance of speed adjustment，flow feeding， lactose induction and treatment of abnormal fermentation) illustrated that only single channel detection can achieve real－time，continuous and online detection，and capture valuable “critical point”information．
Keywords： fermentation； tail gas analysis； single channel； detection
收稿日期：2022－09－01
基金項(xiàng)目：齊魯工業(yè)大學(xué)科教產(chǎn)融合試點(diǎn)工程基礎(chǔ)研究類基金資助項(xiàng)目 (2022PY067)；齊魯工業(yè)大學(xué)科教產(chǎn)重大創(chuàng)新專項(xiàng)(2022JBZ01－06)； 山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目 (重大關(guān)鍵技術(shù))(2016ZDJS07A20)
作者簡(jiǎn)介：公維麗(1988 — )，女，山東臨沂人，副研究員，研究方向?yàn)樯飩鞲衅骷夹g(shù) 、微生物發(fā)酵工程，E－mail：15264110812＠163．com。
通信作者：劉仲匯高級(jí)工程師，E－mail：sws2605384＠163．com。
發(fā)酵尾氣分析指在發(fā)酵過(guò)程中在線檢測(cè)尾氣中 的 CO2 和 O2 的體 積 分 數(shù)，計(jì) 算 呼 吸 代 謝 參 數(shù) CO2 釋放率(Carbon dioxide evolution rate，CER)、攝 氧 率(Oxygen uptake rate，OUR) 和 呼 吸 商 (Respira－ tory quotient，RQ)，得到細(xì)胞代謝信息，是發(fā)酵工程 的一種過(guò)程分析技術(shù)(Process analysis technology， PAT)。 無(wú)論 是 在 微 生 物 生 長(zhǎng) 階 段，還 是 在 產(chǎn) 物 合成階段，CER 的變化都與菌 體 生 長(zhǎng) 狀 態(tài) 、碳 源 的 消耗和供氧情 況 密 切 相 關(guān) 。 OUR 雖然取決于菌體濃度，但是也與發(fā)酵 液 的 營(yíng) 養(yǎng) 成 分 、溶 氧 水 平 、菌 體 的比生長(zhǎng) 速 率 以 及 碳 源 的 種 類 和 濃 度 等 因 素 有 關(guān) 。RQ的變化反 映 了 微 生 物 胞 內(nèi) 代 謝 的 變 化，揭 示 了發(fā)酵過(guò)程中微觀代謝途徑通量的變化，是 微 生 物 菌體生長(zhǎng) 、能量代謝維持 、產(chǎn)物和副產(chǎn)物合成代謝共同作用的結(jié)果[1－7] 。利用這些參數(shù)及相關(guān)性分 析，可 以 更好地對(duì)發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行監(jiān)測(cè) 、分析，從而深入了解發(fā) 酵規(guī)律，優(yōu)化發(fā)酵 工 藝，控 制 發(fā) 酵 過(guò) 程，提 高 發(fā) 酵 產(chǎn) 率和產(chǎn)量，降低成本，加快新品研發(fā)和產(chǎn)業(yè)化 。
與溶解氧和 pH 檢 測(cè) 相 比，尾 氣 分 析 得 到 的 參 數(shù) CER，OUR 和 RQ 在 一定 程度上反映了發(fā)酵過(guò) 程的部分特質(zhì)，揭示了微生物的生理特性，具有生物 學(xué)意義 。尾氣分析時(shí)僅采集 發(fā)酵罐排出的尾氣，不 影響發(fā)酵罐 結(jié) 構(gòu)，不 接 觸 發(fā) 酵 液，無(wú) 染 菌 風(fēng) 險(xiǎn)[8－10]， 更容易被業(yè)界接受，故成為現(xiàn)代發(fā)酵工程的重要分析 手段，已被應(yīng)用于發(fā)酵、制藥、生化、農(nóng)業(yè)、環(huán)保和食品 等領(lǐng)域 。 雖然該技術(shù)已在業(yè)內(nèi)得到應(yīng)用，但是由于歷 史原因以及設(shè)備成本等因素的影響，對(duì)檢測(cè)設(shè)備是否 需要采用獨(dú)立的單 通 道，認(rèn) 識(shí) 依 舊 模 糊 。 因 此，筆 者 從理論與實(shí)際應(yīng)用兩方面對(duì)該問(wèn)題加以分析探討 。
1 發(fā)酵尾氣分析應(yīng)實(shí)時(shí)連續(xù)在線
在 發(fā) 酵 過(guò) 程 中，微 生 物 生 長(zhǎng) 一 般 需 要 經(jīng) 歷 遲 緩 期 、對(duì)數(shù)生 長(zhǎng) 期 、穩(wěn) 定 期 和 衰 亡 期[11] 。 常 規(guī) 的 液 態(tài) 好氧分批發(fā)酵周期一般為數(shù)小時(shí)至數(shù)天 。在看似較 長(zhǎng)的發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵狀態(tài)的轉(zhuǎn)變 往往發(fā)生在很短 的時(shí)間內(nèi)，某些代謝變化可能用時(shí)更短 。
張嗣良等 在《多 尺 度 微 生 物 過(guò) 程 優(yōu) 化》[12] 及 相 關(guān)論 文[13] 中 詳細(xì)闡述了生 物 過(guò) 程 的 “實(shí) 時(shí) 性 ”： 1) 從生物 過(guò)程發(fā)生的時(shí) 間以及 生物技術(shù)發(fā)展特點(diǎn) 來(lái)看，對(duì)于以活細(xì) 胞為主體的細(xì)胞 大規(guī)模培養(yǎng)的生 物反應(yīng)過(guò)程，可粗分為在以基因水平的分子尺度 、代 謝調(diào)節(jié)的細(xì)胞尺度和工藝控制的反應(yīng)器尺度上發(fā)生 的；2) 可將微 生 物 和 細(xì) 胞 在 酶 活 性 水 平 上(包 括 酶 的激活 、抑制，亞基的結(jié)合和解離以及共價(jià)修飾和降 解) 控制的時(shí)間常數(shù)描述在毫秒至秒的范圍內(nèi)，在基 因表達(dá)調(diào)控水平上(誘 導(dǎo) 、轉(zhuǎn) 錄的阻遏和去阻遏) 描 述至分鐘 �？疾煳� 生 物 和 細(xì) 胞 代 謝 調(diào) 節(jié)，在 以 秒 為 單位的時(shí)間尺 度 上 是 合 適 的 。 因 此，作 為 動(dòng) 態(tài) 觀 測(cè) 記錄細(xì)胞代謝狀況 的 發(fā) 酵 尾 氣 分 析 設(shè) 備，應(yīng) 對(duì) 排 出 的尾氣進(jìn)行實(shí)時(shí)連續(xù)在線檢測(cè)，只有這樣，才能準(zhǔn)確 捕捉到發(fā)酵過(guò)程中代謝的改變 。
2 合理利用發(fā)酵過(guò)程中的臨界點(diǎn)
2．1 發(fā)酵過(guò)程中的臨界點(diǎn)
李強(qiáng)等[14] 在《微生物發(fā)酵 中 二 氧 化 碳 釋 放 速 率 變化規(guī)律》中，通過(guò)青霉素 、古龍酸 、二元酸和葡萄糖 酸 4 個(gè)體系的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)及動(dòng)力學(xué)分析，對(duì) CER 的變化規(guī)律進(jìn)行了探 究，研 究 結(jié) 果 表 明：無(wú) 論 是 霉 菌 、酵 母菌 、細(xì) 菌 、單 液 相 體 系 、雙 液 相 體 系，還 是 純 種 發(fā) 酵 、混合菌發(fā) 酵，CER 的 變 化 都 與 體 系 狀 態(tài) 變 化 有 著密切聯(lián)系；CER 曲線上的轉(zhuǎn) 折 點(diǎn) 對(duì) 應(yīng) 的 就 是 發(fā) 酵 狀態(tài)的轉(zhuǎn)變點(diǎn) 。 由該文獻(xiàn)的 CER 曲線可以發(fā)現(xiàn)：在 這些轉(zhuǎn)折點(diǎn)處曲線發(fā)生了方向性改變，即 由 升 轉(zhuǎn) 為 降，或者由降轉(zhuǎn)為 升，曲線出現(xiàn)明顯的峰或谷，發(fā) 酵 體系的狀態(tài)都發(fā)生了顯著改變 。
在發(fā)酵過(guò)程中還存在另一類極具價(jià)值 的 變 化 點(diǎn)，即發(fā)酵體系的狀態(tài)變化由緩慢到快速，或由快速 轉(zhuǎn)為緩慢的時(shí)間點(diǎn)，比如在微生物生長(zhǎng)由遲緩期進(jìn) 入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，由 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)入穩(wěn)定期以及由穩(wěn) 定期進(jìn)入衰亡期的那些時(shí)間點(diǎn)上，都有可能出現(xiàn)該 情況 。在這類時(shí)間點(diǎn)上，雖然發(fā)酵體系的 CER 曲線 沒(méi)有發(fā)生方向性改 變(由 升到降或由降到升)，但 是 發(fā)生了變化速率的 顯 著 改 變，或者說(shuō)發(fā)生了從一個(gè) 發(fā)酵階段轉(zhuǎn)變到另一個(gè)發(fā)酵階段 。這類變化點(diǎn)在發(fā) 酵過(guò)程中普遍存在，不僅有著明確的生物學(xué)意義，而 且具有非常重要的應(yīng)用價(jià)值 �？蓪l(fā)酵過(guò)程中這類 變化速率顯著改變 的 點(diǎn)，以及發(fā)生方向性改變的轉(zhuǎn) 折點(diǎn)統(tǒng)稱為臨界變化點(diǎn)，簡(jiǎn)稱“臨界點(diǎn)”，其特征是發(fā) 酵體系發(fā)生了從一個(gè)狀態(tài)到另一個(gè)狀態(tài)的改變，亦 或從一個(gè)階段到另一個(gè)階段的改變 。
應(yīng)用發(fā)酵尾氣分析技術(shù)進(jìn)行實(shí)時(shí)連續(xù) 在 線 監(jiān) 測(cè)，可方便 、直觀地獲得發(fā)酵過(guò)程中的臨界點(diǎn) 。這些 臨界點(diǎn)提供的豐富信息可以幫助人們辨識(shí)發(fā)酵過(guò)程 狀態(tài)，為 調(diào) 整 攪 拌 轉(zhuǎn) 速／通 氣 量 、流 加 補(bǔ) 料 、基 因 誘 導(dǎo)，以及異常 發(fā)酵處理等一系 列 工藝操 作提供 明確 指導(dǎo)，同時(shí)也為工藝放大提供對(duì)比數(shù)據(jù) 。充分重視和 利用這些臨界點(diǎn)信息對(duì)優(yōu)化發(fā)酵工藝具有重要意義 。
2．2 利用發(fā)酵過(guò)程臨界點(diǎn)指導(dǎo)操作
2．2．1 利用臨界點(diǎn)調(diào)整供氧
溶解氧是好氧發(fā)酵微生物生長(zhǎng)及產(chǎn)物合成所必 需的 。在發(fā)酵過(guò)程 中，特 別是在高密度工程菌培養(yǎng) 中，溶解氧往往 成 為 限 制 性 因 素 。 如何適時(shí)調(diào)整攪 拌轉(zhuǎn)速和通氣量以達(dá)到最適溶解氧，是 發(fā) 酵 工 藝 的 關(guān)鍵點(diǎn)之一[15－17] 。 一般根據(jù)溶解 氧 DO、pH 及 鏡 檢 結(jié)果等進(jìn)行調(diào)整，比較粗放，而利用尾氣分析曲線的 臨界點(diǎn)，則可以準(zhǔn)確把握調(diào)整時(shí)機(jī) 。
在山東省科學(xué) 院 生 物 研 究 所 承 擔(dān) 的“植 酸 酶 工 程菌高密度發(fā)酵智能控制關(guān)鍵技術(shù)”(山東省重點(diǎn)研 發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目 2016ZDJS07A20) 項(xiàng) 目 中，在 10L 實(shí) 驗(yàn) 室發(fā)酵罐上，采用 FGA 發(fā) 酵 尾 氣 分 析 儀，對(duì) 重 組 畢 赤酵母表達(dá)植酸酶過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)在線檢測(cè) 。 發(fā)酵溫 度 30 ℃，初 始 發(fā) 酵 液 體 積 7L，通 氣 量 5L／min，攪拌轉(zhuǎn)速 200r／min 。 發(fā)酵 6h5min 時(shí)，CER 開(kāi) 始 緩 慢上升；發(fā) 酵 25h26 min 時(shí)，CER 出 現(xiàn) 快 速 上 升， 曲線上形成明顯的 臨 界 點(diǎn)，預(yù)示發(fā) 酵進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng) 期，此時(shí) 立刻調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速至 400r／min；之 后 隨 著 CER 的上升，階段性小步調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速達(dá) 530r／min， 并保持至 發(fā) 酵 48h30 min，之 后調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速至 500r／min，直至 發(fā) 酵 結(jié) 束 。 該 發(fā) 酵 過(guò) 程 的 CER 變 化曲線如圖 1 所示 。在該過(guò)程中，發(fā) 酵 15h 時(shí) 進(jìn) 行 甲醇誘導(dǎo)，誘 導(dǎo) 5h 后 開(kāi) 啟 蛋 白 表 達(dá)，SDS－PAGE 檢 測(cè)植酸酶表達(dá)見(jiàn)文獻(xiàn)[18]，最終酶活達(dá) 3 000U／mL。
摘要：發(fā)酵尾氣分析技術(shù)在業(yè)內(nèi)的應(yīng)用已逐漸展開(kāi)，但人們對(duì)單通道檢測(cè)的認(rèn)識(shí)依舊模糊 。從尾氣分析的意義、生物過(guò)程的“實(shí)時(shí)性”以及發(fā)酵過(guò)程的“臨界點(diǎn)”反映發(fā)酵狀態(tài)的改變等方面，闡述了發(fā) 酵尾氣分析應(yīng)采用實(shí)時(shí)、連續(xù)、在線檢測(cè)；通過(guò)以尾氣分析獲得的“臨界點(diǎn)”在發(fā)酵工程中的應(yīng)用(指 導(dǎo)轉(zhuǎn)速調(diào)整、流加補(bǔ)料、乳糖誘導(dǎo)及處理異常發(fā)酵)，進(jìn)一步闡明只有單通道檢測(cè)才能真正做到檢測(cè) 的實(shí)時(shí)、連續(xù)、在線，捕捉到有價(jià)值的“臨界點(diǎn)”信息。
關(guān)鍵詞：發(fā)酵；尾氣分析；單通道；檢測(cè)
中圖分類號(hào)：Q819 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1674－2214(2022)04－0217－05 DOI:10. 16774/j.cnki.issn. 1674-2214.2022.04.009
Discussion on the application ofsingle channel detection in fermentation tail gas
analysis
GONG Weili1，2， LIU Zhonghui1，2， MA Yaohong1，2， SHI Jianguo1，2
(1．Qilu University of Technology (Shandong Academy of Sciences)， Biology Institute，Jinan 250014， China；
2．Shandong Provincial Key Laboratory of Biosensors，Jinan 250014， China)
Abstract： The technology of fermentation tail gas analysis has been gradually developed and applied in the industry，but single－channel detection is still poorly understood．In this paper，we expounded that fermentation tail gas analysis should adopt real－time continuous online detection from the significance of fermentation tail gas analysis，the “real－time”of biological process，and the critical point of fermentation tail gas analysis curve reflecting the change information of process state，and the critical point obtained from tail gas analysis in fermentation engineering (guidance of speed adjustment，flow feeding， lactose induction and treatment of abnormal fermentation) illustrated that only single channel detection can achieve real－time，continuous and online detection，and capture valuable “critical point”information．
Keywords： fermentation； tail gas analysis； single channel； detection
收稿日期：2022－09－01
基金項(xiàng)目：齊魯工業(yè)大學(xué)科教產(chǎn)融合試點(diǎn)工程基礎(chǔ)研究類基金資助項(xiàng)目 (2022PY067)；齊魯工業(yè)大學(xué)科教產(chǎn)重大創(chuàng)新專項(xiàng)(2022JBZ01－06)； 山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目 (重大關(guān)鍵技術(shù))(2016ZDJS07A20)
作者簡(jiǎn)介：公維麗(1988 — )，女，山東臨沂人，副研究員，研究方向?yàn)樯飩鞲衅骷夹g(shù) 、微生物發(fā)酵工程，E－mail：15264110812＠163．com。
通信作者：劉仲匯高級(jí)工程師，E－mail：sws2605384＠163．com。
發(fā)酵尾氣分析指在發(fā)酵過(guò)程中在線檢測(cè)尾氣中 的 CO2 和 O2 的體 積 分 數(shù)，計(jì) 算 呼 吸 代 謝 參 數(shù) CO2 釋放率(Carbon dioxide evolution rate，CER)、攝 氧 率(Oxygen uptake rate，OUR) 和 呼 吸 商 (Respira－ tory quotient，RQ)，得到細(xì)胞代謝信息，是發(fā)酵工程 的一種過(guò)程分析技術(shù)(Process analysis technology， PAT)。 無(wú)論 是 在 微 生 物 生 長(zhǎng) 階 段，還 是 在 產(chǎn) 物 合成階段，CER 的變化都與菌 體 生 長(zhǎng) 狀 態(tài) 、碳 源 的 消耗和供氧情 況 密 切 相 關(guān) 。 OUR 雖然取決于菌體濃度，但是也與發(fā)酵 液 的 營(yíng) 養(yǎng) 成 分 、溶 氧 水 平 、菌 體 的比生長(zhǎng) 速 率 以 及 碳 源 的 種 類 和 濃 度 等 因 素 有 關(guān) 。RQ的變化反 映 了 微 生 物 胞 內(nèi) 代 謝 的 變 化，揭 示 了發(fā)酵過(guò)程中微觀代謝途徑通量的變化，是 微 生 物 菌體生長(zhǎng) 、能量代謝維持 、產(chǎn)物和副產(chǎn)物合成代謝共同作用的結(jié)果[1－7] 。利用這些參數(shù)及相關(guān)性分 析，可 以 更好地對(duì)發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行監(jiān)測(cè) 、分析，從而深入了解發(fā) 酵規(guī)律，優(yōu)化發(fā)酵 工 藝，控 制 發(fā) 酵 過(guò) 程，提 高 發(fā) 酵 產(chǎn) 率和產(chǎn)量，降低成本，加快新品研發(fā)和產(chǎn)業(yè)化 。
與溶解氧和 pH 檢 測(cè) 相 比，尾 氣 分 析 得 到 的 參 數(shù) CER，OUR 和 RQ 在 一定 程度上反映了發(fā)酵過(guò) 程的部分特質(zhì)，揭示了微生物的生理特性，具有生物 學(xué)意義 。尾氣分析時(shí)僅采集 發(fā)酵罐排出的尾氣，不 影響發(fā)酵罐 結(jié) 構(gòu)，不 接 觸 發(fā) 酵 液，無(wú) 染 菌 風(fēng) 險(xiǎn)[8－10]， 更容易被業(yè)界接受，故成為現(xiàn)代發(fā)酵工程的重要分析 手段，已被應(yīng)用于發(fā)酵、制藥、生化、農(nóng)業(yè)、環(huán)保和食品 等領(lǐng)域 。 雖然該技術(shù)已在業(yè)內(nèi)得到應(yīng)用，但是由于歷 史原因以及設(shè)備成本等因素的影響，對(duì)檢測(cè)設(shè)備是否 需要采用獨(dú)立的單 通 道，認(rèn) 識(shí) 依 舊 模 糊 。 因 此，筆 者 從理論與實(shí)際應(yīng)用兩方面對(duì)該問(wèn)題加以分析探討 。
1 發(fā)酵尾氣分析應(yīng)實(shí)時(shí)連續(xù)在線
在 發(fā) 酵 過(guò) 程 中，微 生 物 生 長(zhǎng) 一 般 需 要 經(jīng) 歷 遲 緩 期 、對(duì)數(shù)生 長(zhǎng) 期 、穩(wěn) 定 期 和 衰 亡 期[11] 。 常 規(guī) 的 液 態(tài) 好氧分批發(fā)酵周期一般為數(shù)小時(shí)至數(shù)天 。在看似較 長(zhǎng)的發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵狀態(tài)的轉(zhuǎn)變 往往發(fā)生在很短 的時(shí)間內(nèi)，某些代謝變化可能用時(shí)更短 。
張嗣良等 在《多 尺 度 微 生 物 過(guò) 程 優(yōu) 化》[12] 及 相 關(guān)論 文[13] 中 詳細(xì)闡述了生 物 過(guò) 程 的 “實(shí) 時(shí) 性 ”： 1) 從生物 過(guò)程發(fā)生的時(shí) 間以及 生物技術(shù)發(fā)展特點(diǎn) 來(lái)看，對(duì)于以活細(xì) 胞為主體的細(xì)胞 大規(guī)模培養(yǎng)的生 物反應(yīng)過(guò)程，可粗分為在以基因水平的分子尺度 、代 謝調(diào)節(jié)的細(xì)胞尺度和工藝控制的反應(yīng)器尺度上發(fā)生 的；2) 可將微 生 物 和 細(xì) 胞 在 酶 活 性 水 平 上(包 括 酶 的激活 、抑制，亞基的結(jié)合和解離以及共價(jià)修飾和降 解) 控制的時(shí)間常數(shù)描述在毫秒至秒的范圍內(nèi)，在基 因表達(dá)調(diào)控水平上(誘 導(dǎo) 、轉(zhuǎn) 錄的阻遏和去阻遏) 描 述至分鐘 �？疾煳� 生 物 和 細(xì) 胞 代 謝 調(diào) 節(jié)，在 以 秒 為 單位的時(shí)間尺 度 上 是 合 適 的 。 因 此，作 為 動(dòng) 態(tài) 觀 測(cè) 記錄細(xì)胞代謝狀況 的 發(fā) 酵 尾 氣 分 析 設(shè) 備，應(yīng) 對(duì) 排 出 的尾氣進(jìn)行實(shí)時(shí)連續(xù)在線檢測(cè)，只有這樣，才能準(zhǔn)確 捕捉到發(fā)酵過(guò)程中代謝的改變 。
2 合理利用發(fā)酵過(guò)程中的臨界點(diǎn)
2．1 發(fā)酵過(guò)程中的臨界點(diǎn)
李強(qiáng)等[14] 在《微生物發(fā)酵 中 二 氧 化 碳 釋 放 速 率 變化規(guī)律》中，通過(guò)青霉素 、古龍酸 、二元酸和葡萄糖 酸 4 個(gè)體系的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)及動(dòng)力學(xué)分析，對(duì) CER 的變化規(guī)律進(jìn)行了探 究，研 究 結(jié) 果 表 明：無(wú) 論 是 霉 菌 、酵 母菌 、細(xì) 菌 、單 液 相 體 系 、雙 液 相 體 系，還 是 純 種 發(fā) 酵 、混合菌發(fā) 酵，CER 的 變 化 都 與 體 系 狀 態(tài) 變 化 有 著密切聯(lián)系；CER 曲線上的轉(zhuǎn) 折 點(diǎn) 對(duì) 應(yīng) 的 就 是 發(fā) 酵 狀態(tài)的轉(zhuǎn)變點(diǎn) 。 由該文獻(xiàn)的 CER 曲線可以發(fā)現(xiàn)：在 這些轉(zhuǎn)折點(diǎn)處曲線發(fā)生了方向性改變，即 由 升 轉(zhuǎn) 為 降，或者由降轉(zhuǎn)為 升，曲線出現(xiàn)明顯的峰或谷，發(fā) 酵 體系的狀態(tài)都發(fā)生了顯著改變 。
在發(fā)酵過(guò)程中還存在另一類極具價(jià)值 的 變 化 點(diǎn)，即發(fā)酵體系的狀態(tài)變化由緩慢到快速，或由快速 轉(zhuǎn)為緩慢的時(shí)間點(diǎn)，比如在微生物生長(zhǎng)由遲緩期進(jìn) 入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，由 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)入穩(wěn)定期以及由穩(wěn) 定期進(jìn)入衰亡期的那些時(shí)間點(diǎn)上，都有可能出現(xiàn)該 情況 。在這類時(shí)間點(diǎn)上，雖然發(fā)酵體系的 CER 曲線 沒(méi)有發(fā)生方向性改 變(由 升到降或由降到升)，但 是 發(fā)生了變化速率的 顯 著 改 變，或者說(shuō)發(fā)生了從一個(gè) 發(fā)酵階段轉(zhuǎn)變到另一個(gè)發(fā)酵階段 。這類變化點(diǎn)在發(fā) 酵過(guò)程中普遍存在，不僅有著明確的生物學(xué)意義，而 且具有非常重要的應(yīng)用價(jià)值 �？蓪l(fā)酵過(guò)程中這類 變化速率顯著改變 的 點(diǎn)，以及發(fā)生方向性改變的轉(zhuǎn) 折點(diǎn)統(tǒng)稱為臨界變化點(diǎn)，簡(jiǎn)稱“臨界點(diǎn)”，其特征是發(fā) 酵體系發(fā)生了從一個(gè)狀態(tài)到另一個(gè)狀態(tài)的改變，亦 或從一個(gè)階段到另一個(gè)階段的改變 。
應(yīng)用發(fā)酵尾氣分析技術(shù)進(jìn)行實(shí)時(shí)連續(xù) 在 線 監(jiān) 測(cè)，可方便 、直觀地獲得發(fā)酵過(guò)程中的臨界點(diǎn) 。這些 臨界點(diǎn)提供的豐富信息可以幫助人們辨識(shí)發(fā)酵過(guò)程 狀態(tài)，為 調(diào) 整 攪 拌 轉(zhuǎn) 速／通 氣 量 、流 加 補(bǔ) 料 、基 因 誘 導(dǎo)，以及異常 發(fā)酵處理等一系 列 工藝操 作提供 明確 指導(dǎo)，同時(shí)也為工藝放大提供對(duì)比數(shù)據(jù) 。充分重視和 利用這些臨界點(diǎn)信息對(duì)優(yōu)化發(fā)酵工藝具有重要意義 。
2．2 利用發(fā)酵過(guò)程臨界點(diǎn)指導(dǎo)操作
2．2．1 利用臨界點(diǎn)調(diào)整供氧
溶解氧是好氧發(fā)酵微生物生長(zhǎng)及產(chǎn)物合成所必 需的 。在發(fā)酵過(guò)程 中，特 別是在高密度工程菌培養(yǎng) 中，溶解氧往往 成 為 限 制 性 因 素 。 如何適時(shí)調(diào)整攪 拌轉(zhuǎn)速和通氣量以達(dá)到最適溶解氧，是 發(fā) 酵 工 藝 的 關(guān)鍵點(diǎn)之一[15－17] 。 一般根據(jù)溶解 氧 DO、pH 及 鏡 檢 結(jié)果等進(jìn)行調(diào)整，比較粗放，而利用尾氣分析曲線的 臨界點(diǎn)，則可以準(zhǔn)確把握調(diào)整時(shí)機(jī) 。
在山東省科學(xué) 院 生 物 研 究 所 承 擔(dān) 的“植 酸 酶 工 程菌高密度發(fā)酵智能控制關(guān)鍵技術(shù)”(山東省重點(diǎn)研 發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目 2016ZDJS07A20) 項(xiàng) 目 中，在 10L 實(shí) 驗(yàn) 室發(fā)酵罐上，采用 FGA 發(fā) 酵 尾 氣 分 析 儀，對(duì) 重 組 畢 赤酵母表達(dá)植酸酶過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)在線檢測(cè) 。 發(fā)酵溫 度 30 ℃，初 始 發(fā) 酵 液 體 積 7L，通 氣 量 5L／min，攪拌轉(zhuǎn)速 200r／min 。 發(fā)酵 6h5min 時(shí)，CER 開(kāi) 始 緩 慢上升；發(fā) 酵 25h26 min 時(shí)，CER 出 現(xiàn) 快 速 上 升， 曲線上形成明顯的 臨 界 點(diǎn)，預(yù)示發(fā) 酵進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng) 期，此時(shí) 立刻調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速至 400r／min；之 后 隨 著 CER 的上升，階段性小步調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速達(dá) 530r／min， 并保持至 發(fā) 酵 48h30 min，之 后調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速至 500r／min，直至 發(fā) 酵 結(jié) 束 。 該 發(fā) 酵 過(guò) 程 的 CER 變 化曲線如圖 1 所示 。在該過(guò)程中，發(fā) 酵 15h 時(shí) 進(jìn) 行 甲醇誘導(dǎo)，誘 導(dǎo) 5h 后 開(kāi) 啟 蛋 白 表 達(dá)，SDS－PAGE 檢 測(cè)植酸酶表達(dá)見(jiàn)文獻(xiàn)[18]，最終酶活達(dá) 3 000U／mL。
由圖 1 可知：在臨界點(diǎn)改變攪拌轉(zhuǎn)速后，細(xì)胞快 速進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 。 實(shí)驗(yàn)中根據(jù)臨界點(diǎn)及曲線變化 趨 勢(shì)，恰 當(dāng) 掌握攪拌轉(zhuǎn)速 調(diào) 整時(shí)機(jī)，滿 足 供 氧 需 求，使植酸酶表達(dá)量及酶活均達(dá)較高水平 。
2．2．2 利用臨界點(diǎn)進(jìn)行補(bǔ)料
流加補(bǔ)料－分 批 發(fā) 酵[19－23] 是現(xiàn)代發(fā)酵工 程 普 遍 采用的方式，可以較好地解決底物阻遏，按設(shè)備能力 供氧，減緩代謝有害物的不利影響；尤其對(duì)于基因工 程菌高密度發(fā)酵，流加補(bǔ)料是實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵必不 可少的手段 。流加補(bǔ)料技術(shù)的關(guān)鍵是對(duì)補(bǔ)料時(shí)機(jī)的 把握，利用發(fā)酵尾 氣分析曲線中的臨界點(diǎn)能夠比較 精準(zhǔn)地掌控補(bǔ)料時(shí)機(jī) 。
某大型藥企在重 組 大 腸 桿 菌培養(yǎng)白細(xì) 胞 介 素－ Ⅱ 生產(chǎn)過(guò)程中，在 1t 生產(chǎn)罐上應(yīng)用 FGA 發(fā)酵尾 氣 分析儀，監(jiān)測(cè)尾 氣 變 化，其 發(fā) 酵 過(guò) 程 CER 曲 線 如 圖 2 所 示 。 由 圖 2 可 以 看 出 CO2 的 整 體 變 化 規(guī) 律： 1) 發(fā)酵開(kāi) 始 后，CER 先 有 極 短 的 平 緩 區(qū)，很 快 在 1h32min時(shí)曲線 出 現(xiàn) 快 速 上 升 的 臨 界 點(diǎn)，預(yù) 示 重 組大腸桿菌生長(zhǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，此時(shí)開(kāi)始流加補(bǔ) 料，并根據(jù) DO反饋值調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速，保 持 DO 在 較 高水平 。2) 在 CER迅速上升的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，逐漸提 高流加補(bǔ)料速率，在達(dá)到峰值，出現(xiàn)臨界點(diǎn)時(shí)，流加速 率達(dá)到最大 。3) 在 發(fā) 酵 后 期，補(bǔ) 料 速 率 維 持 在 某 一 穩(wěn)定水平，直至發(fā)酵結(jié) 束 。整 個(gè) 發(fā) 酵 過(guò) 程 約 10h，產(chǎn) 物表達(dá)量 占 菌 體 總 蛋 白 的 40％ 。 發(fā) 酵 過(guò) 程 中 對(duì) 數(shù) 生長(zhǎng)期起點(diǎn)和終點(diǎn)(臨界 點(diǎn)) 的 出 現(xiàn) 都 發(fā) 生 在 1 min 內(nèi)，如非采用實(shí)時(shí)連續(xù)在線檢測(cè)是難以觀察到的 。
2．3 利用臨界點(diǎn)進(jìn)行誘導(dǎo)
在重組大 腸 桿 菌 發(fā) 酵 過(guò) 程 中，通 常 采 用 IPTG 誘導(dǎo)劑進(jìn) 行 誘 導(dǎo) 。 IPTG 誘 導(dǎo) 劑 具 有 一 定 毒 性，對(duì)宿主和代謝產(chǎn)物有抑制作用，且 費(fèi) 用 高 昂，在 工 業(yè) 化 大規(guī)模生產(chǎn)中較難推廣 。乳糖是一種廉價(jià)資源，可以 作為碳源被大腸桿菌代謝利用，有報(bào)道在重組蛋白培養(yǎng)中用其作誘導(dǎo)劑，但尚不普遍，究其原因，除誘導(dǎo)機(jī) 理復(fù)雜外，乳糖誘導(dǎo)時(shí)機(jī)不易把握也是重要因素 。
張毅 等[24] 在 LB 培 養(yǎng) 基 中，分 別 在 對(duì) 數(shù) 生 長(zhǎng) 期 的早 期 、中 期 以 及 后 期 對(duì) 融 合 蛋 白 表 達(dá) 菌 BL21 (DE3)(pFu) 進(jìn)行 乳 糖 誘 導(dǎo)，發(fā) 現(xiàn)：乳糖的加入會(huì)造 成菌體生長(zhǎng)遲滯，在 早 期 、中 期 進(jìn) 行誘導(dǎo)均不理想， 只有在后期進(jìn)行誘 導(dǎo) 效 果 最 佳，此 時(shí)既可以得到較 高的表達(dá)產(chǎn)物，又可以獲得較高 的 菌 體 密度 。 有 研 究報(bào)道[22－30] 表明：在培養(yǎng)基葡萄糖剛剛耗盡，細(xì)胞濃 度增加緩慢或略有下降時(shí)開(kāi)始誘導(dǎo)，效果最佳 。
應(yīng) 用 發(fā) 酵 尾 氣 分 析 技 術(shù)，可 以 直 觀 地 辨 識(shí) 菌 體 生長(zhǎng)的各個(gè)階 段 。 一般在對(duì) 數(shù)生長(zhǎng)期的后期，即 培 養(yǎng)基中葡萄糖剛剛 耗 盡，細(xì)胞濃度增加緩慢或略有 下降時(shí)，尾氣分析的 CER 曲線會(huì)出現(xiàn)一個(gè)由上升轉(zhuǎn) 為下降的臨界點(diǎn)，利用該臨界點(diǎn)可 以方便地確定誘 導(dǎo)時(shí)機(jī)，及時(shí)進(jìn)行乳糖誘導(dǎo) 。
2．2．4 利用臨界點(diǎn)處理異常發(fā)酵
雖然微生物發(fā)酵是一個(gè)非線性時(shí)變系統(tǒng)，包含了 生物、化學(xué)及物理的各種變化，過(guò)程較為復(fù)雜，但是當(dāng) 各 種 條 件 固 定 后，微 生 物 細(xì) 胞 代 謝 又 遵 循 一 定 的 規(guī) 律 。從發(fā)酵尾氣分析得到的大量數(shù)據(jù)來(lái)看，在某種發(fā) 酵體系中，當(dāng)工藝條件確定后，其 分析曲線整體形態(tài) 是確定的，一旦發(fā)生改變，通常 預(yù) 示著某種代謝的改 變 。 因此，捕捉那些異 常 臨 界 點(diǎn)，對(duì)異常發(fā)酵的及早 發(fā)現(xiàn)和處理很有意義，特別是對(duì)工業(yè)大生產(chǎn)和高附加 值的生物制藥更是如此 。就此而言，尾氣分析的敏感 性和實(shí)用性均超過(guò)了 pH 、DO等其他現(xiàn)有檢測(cè)手段 。
在廣東某高校進(jìn)行的重組大腸桿菌發(fā)酵 藥 物 蛋 白實(shí)驗(yàn)中，發(fā)酵開(kāi)始后，經(jīng)過(guò)短暫的遲緩期，CO2 曲線 開(kāi)始緩慢上 升，約 2h 后 發(fā) 酵 快 速 進(jìn) 入 對(duì) 數(shù) 生 長(zhǎng) 期； 20min后，CO2 曲 線 突 然 出 現(xiàn) 了 下 折，CO2 體積分?jǐn)?shù) 迅速下降，在不到 30min 的時(shí)間內(nèi)下降到接種前水平， 鏡檢觀察，發(fā)現(xiàn)此時(shí)發(fā)酵液中的工程菌已經(jīng)消失，判斷 感染了噬菌體，隨即停止發(fā)酵，并迅速進(jìn)行滅菌處理。 該實(shí)驗(yàn)過(guò)程的 CO2 體積分?jǐn)?shù)變化曲線如圖 3 所示。
3 實(shí)時(shí)連續(xù)在線檢測(cè)
3．1 實(shí)時(shí)連續(xù)在線檢測(cè)的意義
利 用 發(fā) 酵 尾 氣 分 析 技 術(shù)，特 別 是 利 用 分 析 曲 線 上的臨界點(diǎn)，監(jiān)測(cè)發(fā)酵過(guò)程中細(xì)胞的代謝變化，可以 為發(fā)酵操作及進(jìn)一步工藝優(yōu)化提供 依 據(jù) 。 發(fā)酵尾氣 分析技術(shù)的關(guān)鍵在于對(duì)發(fā)酵過(guò)程中尾氣的 CO2 及 O2 進(jìn)行實(shí)時(shí)連續(xù)在線監(jiān)測(cè)，只有這樣才能捕捉到發(fā)酵狀 態(tài)改變的臨界點(diǎn)，監(jiān)測(cè)到細(xì)胞代謝狀態(tài)的改變 。 由于 發(fā)酵過(guò)程中臨界點(diǎn)的出現(xiàn)和狀態(tài)的改變往往 發(fā) 生 在 極短的時(shí)間內(nèi)，所以實(shí)時(shí)連續(xù)在線檢測(cè)尤為重要 。
3．2 采用單通道確保實(shí)時(shí)連續(xù)在線檢測(cè)
隨 著 現(xiàn) 代 科 技 的 發(fā) 展，發(fā) 酵 尾 氣 分 析 所 采 用 的 各檢測(cè)部件本身的響應(yīng)時(shí)間非常短，一般在毫秒級(jí)， 但從發(fā)酵罐排氣口到檢測(cè)腔，尾氣的傳輸需要時(shí)間， 相比之下檢測(cè)時(shí)間 可 忽 略 不 計(jì)，故完成一次檢測(cè)的 時(shí)間主要取決于尾氣的傳輸時(shí)間 。
雖然采用一套檢測(cè)部件加轉(zhuǎn)換開(kāi)關(guān)對(duì)多 套 發(fā) 酵 設(shè)備分時(shí)切換輪巡檢測(cè)的方式，可以實(shí)現(xiàn)一套尾氣分 析系統(tǒng)測(cè)定多點(diǎn)尾氣，降低發(fā) 酵 設(shè) 備 的 平 均 成 本，但 是在切換過(guò)程中，氣路轉(zhuǎn)換無(wú) 法 瞬 間 完 成，必 須 反 復(fù) 用后一通道的尾氣頂出前一通道的尾氣，會(huì)造成尾氣 混合帶來(lái)檢測(cè)誤差，此外還存 在 傳 輸 時(shí) 間 長(zhǎng) 、信 號(hào) 延 時(shí)等問(wèn)題，也增加了 染 菌 風(fēng) 險(xiǎn) 。 因 此，在 進(jìn) 行 發(fā) 酵 尾 氣分析檢測(cè)時(shí)，應(yīng) 該 采 用 獨(dú) 立 的 單 通 道 檢 測(cè)，即一套 檢測(cè)設(shè)備連接一個(gè)發(fā)酵罐，唯有采用此方式才可以實(shí) 現(xiàn)實(shí)時(shí)連續(xù)在線檢測(cè)，捕捉到那些極其重要的臨界點(diǎn)。
4 結(jié) 論
應(yīng)用發(fā)酵尾氣分析技術(shù)可以深入了解細(xì)胞的代 謝狀況 。分析曲線上的“臨界點(diǎn)”往往反映了發(fā)酵過(guò) 程狀態(tài)的改變，對(duì)研究發(fā) 酵工藝至關(guān)重要 。 要 捕 捉 這些臨界點(diǎn)就需要進(jìn)行實(shí)時(shí)連續(xù)在線檢測(cè)，唯 有 采 用獨(dú)立的單通 道檢測(cè)方能做到 。 目 前，發(fā) 酵 尾 氣 分 析技術(shù)日臻成熟，尾氣分析裝置也成為發(fā)酵罐的標(biāo) 準(zhǔn)配置 。 隨著設(shè)備的普及和尾氣分析在多方面應(yīng)用 的深入開(kāi)展，業(yè)界對(duì)其應(yīng)用效果的期望愈來(lái)愈高，單 通道檢測(cè) 在發(fā)酵尾氣分析中 的 意 義 會(huì) 日 益 清 晰 明 了，該檢測(cè)方式有望被業(yè)界廣泛接受 。
參考文獻(xiàn)：（略）
標(biāo)簽：
發(fā)酵尾氣分析
在線檢測(cè)
- 基于D2MS借助生成式人工智能(GAI)進(jìn)行生物工藝開(kāi)發(fā)的智能化探索
- 論單通道檢測(cè)在發(fā)酵尾氣分析中的應(yīng)用
- 攪拌罐生物反應(yīng)器培養(yǎng)貼壁細(xì)胞如何選擇微載體
- 利用體外仿生消化實(shí)驗(yàn)制造“健康糞便”，培養(yǎng)健康糞便移植菌
- 以D2MS軟件系統(tǒng)為例講述FDA 21 CFR Part 11對(duì)用戶管理安全的要求
- 傳感器在生物反應(yīng)器中的應(yīng)用
- 灌流細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)降低偶聯(lián)融合蛋白裁剪和質(zhì)量異質(zhì)性的作用
- ATF的補(bǔ)料分批/灌流混合工藝在病毒疫苗生產(chǎn)的應(yīng)用
- 西爾曼年中大促：在線溶氧電極以舊換新并享額外質(zhì)保
- 西爾曼推出新品國(guó)產(chǎn)發(fā)酵光學(xué)溶氧電極，誠(chéng)邀試用！
- 西爾曼高溫光學(xué)溶氧傳感器誠(chéng)招全國(guó)經(jīng)銷商、渠道商
- NOVA中國(guó)市場(chǎng)20周年感恩活動(dòng)落幕，艾貝泰攜手相聚
- 百林科推出新品BioHub Welder全自動(dòng)無(wú)菌接管機(jī)
- 百林科推出BioHub Sealer封管機(jī)助力TPE管路無(wú)菌斷開(kāi)
- 深圳西爾曼科技全國(guó)誠(chéng)招儀器銷售工程師和售后工程師
- 迪必爾發(fā)酵設(shè)備與數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)D2MS社區(qū)版正式發(fā)布！
Copyright(C) 1998-2024 生物器材網(wǎng) 電話：021-64166852;13621656896 E-mail：info@bio-equip.com