µ-Slide 8 Well高腔蓋玻片在鈣成像研究細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的應(yīng)用

鈣是影響多種細(xì)胞過(guò)程的重要信使，包括細(xì)胞遷移、交流和對(duì)刺激物或異物作出反應(yīng)的能力。由于其在細(xì)胞功能中的重要性，細(xì)胞內(nèi)的鈣（稱為細(xì)胞內(nèi)鈣）受到高度調(diào)節(jié)。鈣主要儲(chǔ)存在細(xì)胞器內(nèi)，例如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體，并根據(jù)特定信號(hào)釋放。這種嚴(yán)格的調(diào)節(jié)使細(xì)胞內(nèi)鈣成為了解細(xì)胞功能和信號(hào)動(dòng)力學(xué)的絕佳工具。
 

鈣：細(xì)胞過(guò)程的多功能指示劑

有幾種細(xì)胞內(nèi)鈣的熒光指示劑可用于研究細(xì)胞功能。這些指標(biāo)使研究人員能夠檢查傷口愈合、傳染病、藥物治療等過(guò)程中的細(xì)胞反應(yīng)。

在我們的實(shí)驗(yàn)室中，我們使用鈣信號(hào)作為讀數(shù)來(lái)了解病毒在感染過(guò)程中利用宿主信號(hào)反應(yīng)的能力，并剖析所涉及的信號(hào)通路。為此，我們利用含有熒光鈣指示劑的細(xì)胞活細(xì)胞成像，其中熒光的增加表明細(xì)胞內(nèi)鈣的增加。

輪狀病毒感染的非洲綠猴腎細(xì)胞 (MA104) 的活細(xì)胞成像。MA104 細(xì)胞，以綠色顯示，表達(dá)鈣指示劑 GCaMP6s，其中綠色增加表示細(xì)胞內(nèi)鈣增加。在這個(gè)活體細(xì)胞成像視頻中，輪狀病毒感染的細(xì)胞呈紅色——Hyser 實(shí)驗(yàn)室此前曾報(bào)道，在輪狀病毒感染期間，輪狀病毒會(huì)導(dǎo)致受感染細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)鈣增加，隨后激活鄰近細(xì)胞中的特定信號(hào)通路，從而引起未感染細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào) (Chang-Graham et al., 2020)。

鈣指示劑的種類及應(yīng)用：

鈣指示劑主要分為兩大類：化學(xué)指示劑（即染料）和基因編碼的鈣指示劑（即鈣指示劑被編碼到細(xì)胞系、動(dòng)物模型或系統(tǒng)中）。鈣指示劑已用于使用顯微鏡、高通量篩選和流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行的體內(nèi)和體外工作。然而，我們將專注于使用顯微鏡在體外可視化和量化鈣信號(hào)。用于活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)的鈣指示劑類型取決于預(yù)期的細(xì)胞系、成像長(zhǎng)度以及定性或定量數(shù)據(jù)的預(yù)期結(jié)果等因素。

1. 預(yù)期細(xì)胞系：

對(duì)于原代細(xì)胞系，直接的方法是使用熒光染料（化學(xué)指示劑），其中熒光鈣指示劑被簡(jiǎn)單地添加到培養(yǎng)的細(xì)胞中，并可以在孵育期后成像。這些染料也是首次實(shí)驗(yàn)收集初步數(shù)據(jù)的極好方法。使用熒光染料時(shí)的一個(gè)重要提示是在添加之前和之后徹底清洗細(xì)胞，因?yàn)槿玖蠒?huì)導(dǎo)致高背景熒光，使得在顯微鏡和活體成像期間更難以正確聚焦細(xì)胞。

與基因編碼的鈣指示劑相比，熒光染料通常更亮、更穩(wěn)定。然而，染料通常不如遺傳傳感器特異，并且可以具有更高的背景熒光。在活細(xì)胞成像中，熒光染料（包括 Fura-2AM、Fluo-4AM、Indo 1AM 等）可以有效地進(jìn)行短期活細(xì)胞成像。一個(gè)潛在的警告是，在某些細(xì)胞中，細(xì)胞可能會(huì)保留染料或無(wú)法正確加載到某些細(xì)胞類型或亞群中。此外，隨著時(shí)間的推移，細(xì)胞傾向于抽出染料。雖然添加陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑可以防止細(xì)胞泵出染料，但這些抑制劑可能對(duì)某些細(xì)胞類型具有細(xì)胞毒性，如果使用其他治療方法評(píng)估鈣信號(hào)的變化，可能會(huì)使情況復(fù)雜化。鈣染料的一個(gè)重要考慮因素是使用抑制劑還是激動(dòng)劑。抑制劑和激動(dòng)劑也可能影響鈣染料反映類似于天然組織中的表達(dá)的能力。

在用 ADP 進(jìn)行激動(dòng)劑治療期間，人腸道類器官單層的實(shí)時(shí)、短期成像。這些有機(jī)體單層以綠色表達(dá)鈣指示劑 GCaMP6s。ADP 是一種已知的激動(dòng)劑，用于在細(xì)胞中引發(fā)細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)傳導(dǎo)。激動(dòng)劑治療是測(cè)試治療劑量反應(yīng)的極好方法。

2. 成像長(zhǎng)度

時(shí)機(jī)就是一切。對(duì)于活細(xì)胞成像，時(shí)間長(zhǎng)度和間隔是需要牢記的重要參數(shù)。成像過(guò)程中的主要問題是光漂白和光毒性。應(yīng)避免連續(xù)應(yīng)用激發(fā)光，重要的是選擇足夠強(qiáng)的曝光時(shí)間和光功率來(lái)檢測(cè)鈣信號(hào)，但不要過(guò)強(qiáng)，以免對(duì)細(xì)胞造成損害。成像的長(zhǎng)度將取決于實(shí)驗(yàn)。對(duì)于測(cè)試激動(dòng)劑或細(xì)胞反應(yīng)，這通常是 5-20 分鐘的較短成像運(yùn)行，每 1-2 秒捕獲一次圖像。對(duì)于研究傷口修復(fù)或病毒感染期間鈣信號(hào)傳導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)，我們會(huì)在 18-20 小時(shí)內(nèi)成像，每分鐘捕捉一次圖像。

輪狀病毒感染的非洲綠猴腎細(xì)胞 (MA104) 的活細(xì)胞成像。MA104 細(xì)胞，以綠色顯示，表達(dá)鈣指示劑 GCaMP6s，其中綠色增加表示細(xì)胞內(nèi)鈣增加。在這個(gè)活細(xì)胞成像視頻中，輪狀病毒感染的細(xì)胞呈紅色——Hyser 實(shí)驗(yàn)室此前曾報(bào)道，在輪狀病毒感染期間，輪狀病毒會(huì)導(dǎo)致受感染細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)鈣增加，隨后激活鄰近細(xì)胞中的特定信號(hào)通路，從而引起未感染細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)。

鈣成像LED光源

pE-340 fura和pE-800 fura提供了最全面的鈣成像系統(tǒng)，強(qiáng)大而高效的 LED 提供 340-635 nm 的光譜覆蓋范圍，適用于所有流行的鈣指示劑、pH 指示劑、視蛋白以及從 Fura-2 到 Cy5 的日常熒光熒光團(tuán)。通過(guò) USB、TTL 或模擬實(shí)現(xiàn)對(duì)所有八個(gè)通道的單獨(dú)控制，以便輕松地將每個(gè) LED 與選定的鈣指示劑或熒光團(tuán)組匹配。與激光不同，LED 更寬的光譜輸出可以通過(guò)使用濾光片進(jìn)行細(xì)化，以激發(fā)一系列染料，從而擴(kuò)大的覆蓋范圍。使用新的 LED 照明光源，可以將更少的 Fura-2 染料加載到細(xì)胞中，同時(shí)仍保持相同的測(cè)量鈣濃度和良好的信噪比。由于染料毒性降低，所需染料的減少不僅提高了細(xì)胞活力，而且還降低了每次實(shí)驗(yàn)的成本,通過(guò)波長(zhǎng)切換和濾光片定制波長(zhǎng)輸出的能力意味著實(shí)驗(yàn)不再受光源的限制，即使在未來(lái)需求發(fā)生變化或新染料出現(xiàn)時(shí)也是如此。

活細(xì)胞成像的技巧

考慮要使用的細(xì)胞系很重要。為了研究鈣動(dòng)力學(xué)（或其他細(xì)胞信號(hào)），使用形成為單層的細(xì)胞系將確保感興趣的區(qū)域?qū)⒈３志劢挂圆东@信號(hào)動(dòng)力學(xué)以獲得最佳視頻質(zhì)量和干凈的量化。對(duì)于涉及細(xì)胞間通訊和鈣動(dòng)力學(xué)的實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞系匯合度也是一個(gè)重要的考慮因素。為了獲得最佳質(zhì)量的成像，選擇合適的載玻片非常重要。有些細(xì)胞培養(yǎng)物更喜歡玻璃而不是光學(xué)級(jí)塑料載玻片，因此最好測(cè)試腔室載玻片。我們?yōu)槲覀兊募?xì)胞系使用ibiTreat  µ-Slide 8 Well高腔蓋玻片。

µ-Slide 8 Well high（貨號(hào)80806）

對(duì)于活細(xì)胞成像，重要的是以允許形成融合的單層但不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞過(guò)度擁擠和結(jié)塊的密度對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鋪板。最后一個(gè)技巧是在成像過(guò)程中使用合適的介質(zhì)。許多傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)基含有酚紅，會(huì)導(dǎo)致高背景熒光。這使得在成像過(guò)程中很難將真實(shí)信號(hào)與背景噪聲分開。因此，用 PBS 清洗細(xì)胞并用無(wú)酚紅培養(yǎng)基或用于活細(xì)胞成像的市售培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基非常重要。

毒胡蘿卜素治療前后非洲綠猴腎細(xì)胞 (MA104) 的活體短期成像。MA104 細(xì)胞，以綠色顯示，表達(dá)鈣指示劑 GCaMP6s，其中綠色增加表示細(xì)胞內(nèi)鈣增加。毒胡蘿卜素是一種眾所周知的肌細(xì)胞/內(nèi)質(zhì)網(wǎng) Ca2+-ATP 酶抑制劑（這對(duì)于從胞質(zhì)溶膠中螯合鈣很重要）。通過(guò)這種抑制作用，毒胡蘿卜素誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，并可導(dǎo)致源自內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的細(xì)胞內(nèi)鈣增加。

 

參考：

Chang-Graham AL, Perry JL, Engevik MA, Engevik KA, Scribano FJ, Gebert JT, Danhof HA, Nelson JC, Kellen JS, Strtak AC, Sastri NP, Estes MK, Britton RA, Versalovic J, Hyser JM. Rotavirus induces intercellular calcium waves through ADP signaling. Science. 2020 Nov 20;370(6519):eabc3621. doi: 10.1126/science.abc3621.