超分辨率顯微鏡在腎臟成像中的應(yīng)用和原理

“ 腎臟是人體的重要器官，它的基本功能是生成尿液，借以清除體內(nèi)代謝產(chǎn)物及某些廢物、毒物，同時(shí)經(jīng)重吸收功能保留水分及其他有用物質(zhì)，如葡萄糖、蛋白質(zhì)、氨基酸、鈉離子、鉀離子、碳酸氫鈉等，以調(diào)節(jié)水、電解質(zhì)平衡及維護(hù)酸堿平衡。腎臟同時(shí)還有內(nèi)分泌功能，生成腎素、促紅細(xì)胞生成素、活性維生素D3、前列腺素、激肽等，又為機(jī)體部分內(nèi)分泌激素的降解場(chǎng)所和腎外激素的靶器官。腎臟的這些功能，保證了機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，使新陳代謝得以正常進(jìn)行。”
 

腎臟需要滿(mǎn)足多樣化的生理功能，因而擁有了迷人的復(fù)雜結(jié)構(gòu)。起初，對(duì)腎臟的研究?jī)H限于宏觀觀察，其對(duì)腎臟疾病診斷的貢獻(xiàn)無(wú)疑是有限的。宏觀觀察描述了臨床表現(xiàn)，但潛在的發(fā)病機(jī)制卻無(wú)法解釋。腎臟生理學(xué)和病理生理學(xué)方面的成就很大程度上歸功于顯微鏡領(lǐng)域的持續(xù)進(jìn)步。1666 年，解剖學(xué)家 Malpighi 用光學(xué)顯微鏡檢查了腎臟組織，該顯微鏡的放大倍率估計(jì)為 ×25-30，并首次將腎小球描述為“尿液與血液分離的腺體”。這一發(fā)現(xiàn)一直被忽視，直到 1842 年，William Bowman 才用更大放大倍率的光學(xué)顯微鏡解開(kāi)了腎單位結(jié)構(gòu)。Bowman 發(fā)現(xiàn)腎小球周?chē)�囊�?Bowman 囊）在解剖學(xué)上與腎小管的第一部分相連 。1862 年，Jacob Henle 描述了以他的名字命名的環(huán)狀小管段，連接皮質(zhì)小管和腎乳頭。由于引入了光學(xué)顯微鏡，腎臟疾病的組織形態(tài)學(xué)分類(lèi)成為可能。觀察患病腎臟中發(fā)生的情況使人們能夠了解具有相似臨床表現(xiàn)的患者之間的病理變化有很大差異。然而，最初對(duì)腎組織病理變化的研究是在尸檢樣本上進(jìn)行的，主要聚焦于對(duì)慢性疾病的描述，缺乏關(guān)于腎臟病理演變的信息，并且存在自溶現(xiàn)象的技術(shù)問(wèn)題，限制了對(duì)腎臟疾病的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)。1951 年，腎活檢的引入使得不僅可以直接觀察和研究慢性腎臟疾病，還可以直接觀察和研究急性腎臟疾病。與此同時(shí)，顯微鏡逐漸變得更加復(fù)雜，靈敏度和分辨率逐漸提高到納米級(jí)。在這篇綜述中，概述了顯微鏡技術(shù)的進(jìn)步對(duì)腎臟基礎(chǔ)發(fā)現(xiàn)研究，尤其是新興技術(shù)發(fā)展演變帶來(lái)的可能性。

01研究結(jié)果

1、腎臟免疫病理學(xué)可視化
1.1 免疫標(biāo)記和熒光顯微鏡
免疫熒光已被納入評(píng)估冷凍腎活檢標(biāo)本的診斷程序中。主要用于腎小球腎炎、IgA 腎病，以及感染后腎小球腎炎和膜增生性腎小球腎炎。
1.2 共聚焦顯微鏡
共聚焦顯微鏡的引入，使熒光顯微鏡得到極大技術(shù)改進(jìn)。共聚焦顯微鏡完成了第一次在實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭袑?duì)腎臟進(jìn)行體內(nèi)研究，并通過(guò)微穿刺后觀察熒光分子，允許在生理和病理?xiàng)l件下研究腎小管功能。
利用共聚焦顯微鏡沿 z 軸順序成像光學(xué)切片，及特定分析軟件對(duì)較厚組織標(biāo)本進(jìn)行 3D 渲染，可對(duì) 2D 分析進(jìn)行糾正和補(bǔ)充。但共聚焦顯微鏡仍然無(wú)法分辨小于 200 nm 的細(xì)節(jié)。
 

圖1. 共聚焦顯微鏡、電子顯微鏡及多光子顯微鏡的成像及原理

2、腎小球?yàn)V過(guò)屏障：電子顯微鏡
1931 年，電子顯微鏡問(wèn)世，因其使用加速電子束而不是光束作為激發(fā)源，進(jìn)而達(dá)到了更高的分辨率—— 0.2 nm。由于分辨率的提高，很快就發(fā)現(xiàn)腎小球不僅僅是一個(gè)機(jī)械過(guò)濾器，而是一個(gè)三層組成的極其復(fù)雜的器官：內(nèi)皮細(xì)胞、腎小球基底膜和足細(xì)胞。電子顯微鏡是一種強(qiáng)大的工具，不僅可以用于理解正常腎小球超微結(jié)構(gòu)，還可以用于理解腎臟生理學(xué)和病理生理學(xué)。對(duì)人體樣本或?qū)嶒?yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行的大量研究表明，不同的疾病過(guò)程與一組獨(dú)特的超微結(jié)構(gòu)改變模式相關(guān)，這意味著對(duì)腎臟疾病分類(lèi)系統(tǒng)的進(jìn)一步更新。
電子顯微鏡技術(shù)仍在不斷發(fā)展，塊面掃描電鏡允許對(duì)腎小球?yàn)V過(guò)屏障從 2D 視圖到 3D 視圖，其分辨率足以跟蹤健康小鼠、患病小鼠和腎臟發(fā)育過(guò)程中最薄細(xì)胞過(guò)程的納米結(jié)構(gòu)。且電子顯微鏡可與X 射線(xiàn)顯微鏡耦合以在超微結(jié)構(gòu)水平上對(duì)細(xì)胞或細(xì)胞部分進(jìn)行元素分析。
 

3、使用多光子顯微鏡觀察腎臟生理
多光子顯微鏡為腎臟研究提供了進(jìn)一步的進(jìn)展，即同時(shí)實(shí)時(shí)研究腎功能和結(jié)構(gòu)關(guān)系的可能性 。與傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡不同，增加了深層組織滲透并最大限度地減少了光毒性。這使研究人員前所未有的直接在活體動(dòng)物中可視化動(dòng)態(tài)細(xì)胞過(guò)程。多光子顯微鏡允許量化基本腎功能和病理改變，例如腎小球通透性、血管血流量、單腎單位腎小球?yàn)V過(guò)率和腎小管流量 。此外，多光子顯微鏡允許研究響應(yīng)損傷的細(xì)胞內(nèi)過(guò)程，進(jìn)一步的技術(shù)改進(jìn)允許活體成像持續(xù)數(shù)天至數(shù)周。多光子顯微鏡也可以使用無(wú)標(biāo)記成像技術(shù)，利用天然自發(fā)熒光來(lái)研究腎細(xì)胞的代謝狀態(tài)。
活體顯微鏡的最新創(chuàng)新是微型多光子內(nèi)窺鏡，這種微創(chuàng)多光子顯微鏡可能為實(shí)時(shí)體內(nèi)診斷鋪平道路，無(wú)需去除組織，而且時(shí)間很短。

4、3D 腎臟：組織清除技術(shù)和擴(kuò)展顯微鏡檢查
腎組織不透明，使腎臟成為最具光學(xué)挑戰(zhàn)性的器官之一。組織清除技術(shù)的目的即是將不透明的組織轉(zhuǎn)換為透明的組織，保留蛋白質(zhì)并最終保留熒光標(biāo)記，以對(duì)厚組織切片進(jìn)行成像。光學(xué)清除與最先進(jìn)的顯微鏡相結(jié)合提供了形態(tài)測(cè)量分析的可能性，例如在厚組織甚至完整腎臟中量化腎小球體積和數(shù)量。其他應(yīng)用包括分析不同的小管段、它們的功能和量化足細(xì)胞損失 。
為了對(duì)大量組織進(jìn)行成像，同時(shí)解析精細(xì)的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)，最近還引入了另一種新的技術(shù)方法，即擴(kuò)展顯微鏡 。這種技術(shù)是將整個(gè)器官物理擴(kuò)展 4 到 5 倍，同時(shí)保留整體架構(gòu)和 3D 蛋白質(zhì)組內(nèi)容。使用在樣品中直接合成的膨脹聚合物，與光的衍射極限相近的分子在空間中各向同性地分離到更遠(yuǎn)的距離，因此即使通過(guò)傳統(tǒng)的熒光顯微鏡也可以進(jìn)行光學(xué)解析。體積成像的進(jìn)步允許對(duì)整個(gè)器官進(jìn)行高分辨率 3D 分析，深度成像的主要限制現(xiàn)在表現(xiàn)為抗體穿透組織的能力。

5、代謝特征研究：頻域熒光壽命成像顯微鏡
腎臟是線(xiàn)粒體含量很高的代謝器官。NADH 的還原形式和其他代謝物具有天然熒光，這種自發(fā)熒光可用作氧化還原狀態(tài)的指標(biāo)。然而，這些內(nèi)源性熒光團(tuán)的發(fā)射光譜是重疊的，不可能單獨(dú)識(shí)別它們。但是熒光壽命（即熒光的時(shí)間衰減）有顯著差異。因此，熒光壽命成像顯微鏡允許研究代謝特征。頻域熒光壽命成像顯微鏡有望為健康和疾病中的體內(nèi)腎臟代謝提供進(jìn)一步的見(jiàn)解。
 
6、突破極限：腎臟超分辨率成像
標(biāo)準(zhǔn)光學(xué)顯微鏡面臨 200 nm 的光學(xué)分辨率限制。作為納米顯微鏡時(shí)代的起點(diǎn)，超分辨率成像的新技術(shù)允許熒光顯微鏡成像超出其衍射極限。這些方法結(jié)合了納米級(jí)分辨率和多色熒光標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)。為表彰這些創(chuàng)新的潛在影響，2014 年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予 Eric Betzig、Stefan Hell 和 William Moerner，因?yàn)樗麄冮_(kāi)發(fā)了超分辨熒光顯微鏡。不同的超分辨率成像策略可用于解決不同的生物學(xué)問(wèn)題。這些方法可以分為兩大類(lèi)，具體取決于超分辨率是在單分子水平還是在整體水平上。

圖2. STED顯微鏡原理及與共聚焦顯微鏡的成像對(duì)比

6.1 集成技術(shù)
基于集成的技術(shù)通過(guò)在時(shí)間和空間上調(diào)制激發(fā)光束來(lái)打破衍射極限。其中，超分辨率受激發(fā)射耗盡（STED）成像使用兩種激光，一種是激發(fā)激光器，另一種是疊加的紅移耗盡激光器（STED 激光器），呈甜甜圈形狀，以抑制熒光團(tuán)的熒光發(fā)射位于激發(fā)的中心。這種抑制是通過(guò)受激發(fā)射實(shí)現(xiàn)的，并且只允許收集來(lái)自尺寸低于衍射極限的焦點(diǎn)的信號(hào)。 

STED 顯微鏡需要用于樣品制備、特殊熒光團(tuán)和技術(shù)培訓(xùn)的特定實(shí)驗(yàn)方法。出于這個(gè)原因，在過(guò)去幾年里，另一種超分辨率技術(shù)——結(jié)構(gòu)照明顯微鏡 (SIM) 得到了更多的關(guān)注，它可以將衍射極限橫向和軸向擴(kuò)展兩倍。SIM 使用具有細(xì)條紋照明圖案的寬視野顯微鏡設(shè)置，允許在較低空間頻率下捕獲高頻信息（對(duì)應(yīng)于樣品中的精細(xì)細(xì)節(jié)）。通過(guò)獲取具有不同相位和方向的照明模式的多幅圖像，可以重建高分辨率圖像。SIM 與標(biāo)準(zhǔn)熒光團(tuán)兼容，不需要特定的樣品制備并允許 3D 可視化。各種微小病變的成功識(shí)別，既表現(xiàn)出納米級(jí)病理的疾病改變的能力證實(shí)了 SIM 是一種很有前途的常規(guī)診斷工具。

6.2 基于單分子定位的成像方法
此類(lèi)技術(shù)依賴(lài)于循環(huán)打開(kāi)和關(guān)閉太近而無(wú)法解析的單個(gè)熒光分子的可能性。在這些方法中，衍射受限區(qū)域內(nèi)的分子可以在不同的時(shí)間點(diǎn)被激活，以便它們可以單獨(dú)成像，然后通過(guò)計(jì)算找到它們的中心以納米精度定位。在這些方法中，隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡 (STORM) 于 2013 年首次引入腎臟研究，一項(xiàng)研究以納米精度揭示了 GBM 的復(fù)雜分子組織，包括分子的方向 。在罕見(jiàn)的先天性腎病綜合征的小鼠模型中，STORM 揭示了靜脈注射后 GBM 中層粘連蛋白 521 的整合和正確定向，為患者的高級(jí)治療選擇開(kāi)辟了道路。另一項(xiàng)研究以分子尺度分辨率描述了足細(xì)胞中肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的組織。

圖3. SIM顯微鏡及STORM顯微鏡原理與成像實(shí)例

7、原子水平可視化基本生物分子 3D 結(jié)構(gòu)：低溫電子顯微鏡
研究基本生物分子結(jié)構(gòu)的可能性?xún)H限于電子顯微鏡，因其具有極高的幾nm分辨率。但強(qiáng)電子束造成的樣品損壞、低圖像對(duì)比度和與電子相互作用后的分子運(yùn)動(dòng)或難以在電子顯微鏡室內(nèi)施加的真空中保存生物樣品中的水分，使得無(wú)法解析低于此尺寸的分子。冷卻樣品可以減少水分蒸發(fā)和電子誘導(dǎo)的損傷。根據(jù)這個(gè)想法，低溫電子顯微鏡在 1950 年代被引入。

在腎臟研究中，基本蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)是在原子水平上確定的，低溫電子顯微鏡正適用于此種場(chǎng)景。

8、了解腎臟疾病的分子基礎(chǔ)：整合腎臟顯微鏡
基質(zhì)輔助激光解吸/電離成像質(zhì)譜 (MALDI-IMS) 允許特異性且無(wú)標(biāo)記地同時(shí)繪制組織中分子全譜圖，直接在組織切片上以高分辨率同時(shí)測(cè)量數(shù)百種不同的分子。在 MALDI-IMS 實(shí)驗(yàn)中，冷凍或石蠟包埋的薄組織切片涂有吸收激光能量并促進(jìn)組織分析物電離的基質(zhì)。質(zhì)譜儀中的分析為每個(gè) x/y 坐標(biāo)生成一個(gè)光譜。在 MALDI 測(cè)量之后，可以使用傳統(tǒng)的組織化學(xué)和免疫組織化學(xué)程序?qū)ν�一組織切片進(jìn)行染色，以將分子模式與組織學(xué)細(xì)節(jié)相結(jié)合。在腎臟研究中，MALDI-IMS 用于研究正常和患病組織中的藥物、代謝物、脂質(zhì)、肽和蛋白質(zhì) 。

MALDI-IMS 最常見(jiàn)的應(yīng)用之一是鑒定分子標(biāo)記以對(duì)腎細(xì)胞癌進(jìn)行分類(lèi)并在分子和組織學(xué)水平上確定癌組織和正常組織之間的真實(shí)界限。MALDI-IMS 也已成功用于研究腎臟藥物毒性，以提供由候選藥物介導(dǎo)的毒性腎臟損傷機(jī)制的早期檢測(cè)。此外，MALDI-IMS 用于研究脂質(zhì)及其在腎臟病理學(xué)中的作用，如糖尿病腎病、急性腎損傷和多囊腎病，還用于揭示內(nèi)源性代謝特征，以便更深入地了解疾病相關(guān)機(jī)制。還可用于確定生物標(biāo)志物的分子圖譜，這些生物標(biāo)志物可能是新的潛在診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物。

表1. 各類(lèi)顯微成像技術(shù)對(duì)腎臟研究的適用方向

02 研究總結(jié)

腎臟生理和病理生理機(jī)制方面的重要成就很大程度上歸功于顯微鏡技術(shù)的進(jìn)步。人們對(duì)腎臟結(jié)構(gòu)的了解大部分是基于解剖顯微鏡師使用光學(xué)顯微鏡和后來(lái)通過(guò)電子顯微鏡提供的超微結(jié)構(gòu)分析的基本描述。這兩種技術(shù)被用于腎臟疾病的第一個(gè)分類(lèi)系統(tǒng)并不斷更新。當(dāng)下，一系列新興的成像技術(shù)增加了對(duì)時(shí)間和空間維度的進(jìn)一步分析。共聚焦顯微鏡使研究者能夠沿 z 軸順序可視化光學(xué)切片，并且特定分析軟件使較厚組織標(biāo)本的三維渲染成為可能。多光子顯微鏡使研究者能夠同時(shí)實(shí)時(shí)進(jìn)行腎功能研究和腎結(jié)構(gòu)研究。熒光壽命成像顯微鏡可以研究代謝物的空間分布。超分辨率顯微鏡將靈敏度和分辨率提高到納米級(jí)。借助低溫電子顯微鏡，研究人員可以直接在組織中以原子水平觀察單個(gè)生物分子，并了解它們?cè)趤喖?xì)胞水平上的相互作用。最后，基質(zhì)輔助激光解吸/電離成像質(zhì)譜允許以高分辨率同時(shí)測(cè)量組織切片上的數(shù)百種不同分子。

成像技術(shù)的不斷改進(jìn)逐步解決了腎臟研究中的許多關(guān)鍵技術(shù)障礙，并允許動(dòng)態(tài)描繪正常和患病腎臟的結(jié)構(gòu)和功能。新顯微鏡技術(shù)的出現(xiàn)促成了基礎(chǔ)科學(xué)發(fā)現(xiàn)，并隨之改變了人們對(duì)腎臟生理學(xué)和病理生理學(xué)的認(rèn)識(shí)，如今可以進(jìn)行 3D 可視化甚至進(jìn)行視頻拍攝，增加了第四個(gè)觀察維度——時(shí)間。隨著超分辨率顯微鏡的最新技術(shù)創(chuàng)新和分子成像技術(shù)的進(jìn)步，研究人員現(xiàn)在可以直接在組織中可視化單個(gè)生物分子，并確定它們?nèi)绾卧诩?xì)胞和亞細(xì)胞水平上相互作用。將這些工具應(yīng)用于病理腎臟標(biāo)本，將側(cè)重于臨床活檢中的分子和亞細(xì)胞細(xì)節(jié)，未來(lái)會(huì)對(duì)疾病的重新分類(lèi)帶來(lái)可能。
 

參考文獻(xiàn)：

1. Maria Lucia Angelotti, Giulia Antonelli, Carolina Conte, Paola Romagnani, Imaging the kidney: from light to super-resolution microscopy, Nephrology Dialysis Transplantation, Volume 36, Issue 1, January 2021, Pages 19–28, https://doi.org/10.1093/ndt/gfz136