鸚鵡熱衣原體的生物學(xué)性狀及鑒定與檢測方法

鸚鵡熱衣原體屬于衣原體目（Chlamydiales）、衣原體科（Chlamydiaceae）、衣原體屬（Chlamydia）中的一種微生物，嚴(yán)格細胞內(nèi)寄生。最初認(rèn)為鸚鵡是該病原體的宿主而將其引起的疾病稱為鸚鵡熱（psittacosis），又名鳥疫（ornithosis）。
 
一、生物學(xué)性狀
 
1、基本形態(tài)
 
鸚鵡熱衣原體為革蘭氏陰性，光學(xué)顯微鏡下可見，比細菌小比病毒大，直徑0.3μm、0.4μm。細胞壁的結(jié)構(gòu)和成分與其他革蘭氏陰性菌相似，但沒有或有微量胞壁酸，細胞壁上有屬特異脂多糖抗原。細胞質(zhì)中有DNA和RNA，并有不完全的酶系統(tǒng)，在宿主細胞質(zhì)的空泡內(nèi)增生，具有特異性包涵體。
 
2、培養(yǎng)特性和生化特性
 
衣原體的人工培養(yǎng)可通過雞胚、乳鼠和組織培養(yǎng)等方法。將衣原體接種6～8d齡雞胚卵黃囊中，36～37℃孵育5～6d，雞胚死亡�？梢姷铰腰S膜充血，易剝離，絨毛尿囊膜水腫．部分胚體有小出血點。卵黃囊膜涂片有多量的衣原體原體。有時可在細胞漿中見到包涵體。將衣原體感染的雞胚卵黃囊保存于−70℃環(huán)境下，衣原體至少可存活10年以上。
 
此外也能在McCoy細胞、鼠L細胞、Hela細胞、Vero細胞、BHK21細胞、BGM細胞、Chang氏人肝細胞內(nèi)生長繁殖。離心或用X線照射細胞，可使更多的衣原體吸附到易感細胞表面而提高細胞培養(yǎng)陽性率。鸚鵡熱衣原體經(jīng)腹腔接種，性病淋巴肉芽腫衣原體腦內(nèi)接種可使小白鼠感染。
 
鸚鵡熱衣原體有獨特的發(fā)育周期，具有原體（elementary body，EB）和網(wǎng)狀體（reticular body，RB）2個發(fā)育階段。
 
原體（感染相），存在于細胞外，形體較小，呈球形，直徑0.2～0.4μm，姬姆薩氏染色呈紫色，馬基維羅氏染色呈紅色。原體不具有生物活性，但可以抵抗環(huán)境壓力，可以在宿主體外存活。
 
網(wǎng)狀體，又稱始體（initial body，IB），呈圓形或不規(guī)則形，結(jié)構(gòu)疏松，直徑0.7～1.5μm，姬姆薩氏染色和馬基維羅氏染色均呈藍色。網(wǎng)狀體由原體進入細胞漿后發(fā)育增大形成，是衣原體新陳代謝活化的表現(xiàn)，可利用宿主細胞機能，通過二分裂方式反復(fù)分裂生成新一代原體，在宿主細胞漿內(nèi)形成包涵體，此時無傳染性。隨宿主細胞破裂，存在于包涵體內(nèi)的原體可從細胞漿內(nèi)釋放出來，再感染其他細胞，開始新的發(fā)育周期，整個發(fā)育周期需48～72h。
 
鸚鵡熱衣原體對理化因素抵抗力不強。在70%酒精、2%來蘇水、2%氫氧化鈉、1%鹽酸、3%過氧化氫及硝酸溶液中數(shù)分鐘內(nèi)可失去感染力。0.5%石炭酸、0.1%福爾馬林于24h內(nèi)可將其殺死。耐冷不耐熱，56℃5min，37℃48h可滅活，但−70℃環(huán)境可存活數(shù)年。外界干燥的條件下可存活5周。在室溫和日光下最多能存活6d，紫外線對衣原體有很強的殺滅作用。在水中可存活17d。四環(huán)素、氯霉素和紅霉素等抗生素有抑制其繁殖作用。
 
3、毒性
 
鸚鵡衣原體可在其眾多宿主動物中引起廣譜疾病，典型臨床表現(xiàn)為高熱、惡寒、頭痛、肌痛、咳嗽和肺部浸潤性病變等特征。一般癥狀頗似感冒或呼吸道感染，但多見發(fā)生肺炎，易于誤診。
 
二、鑒定及檢測方法
 
依病禽、鳥等臨床上出現(xiàn)精神萎頓、結(jié)膜炎、脫水、消瘦、極度衰竭呈惡病質(zhì)和排出綠色膠凍狀糞便，可作出初步判斷。剖檢發(fā)現(xiàn)脾、肝腫大，纖維素性氣囊炎，心包炎和腹膜炎，肺充血，腸管充血，則需進一步進行實驗室診斷。
 
我國對嗜衣原體的檢測方法主要有病原學(xué)檢查、血清學(xué)檢測和分子生物學(xué)檢測。
 
（一）病原學(xué)檢查
 
病原學(xué)檢查是確診的重要方法，包括顯微鏡檢查和細胞培養(yǎng)法。病原學(xué)檢查陽性率不高（20%左右），需一定的技術(shù)及設(shè)備條件，同時應(yīng)注意實驗室污染。
 
1、顯微鏡檢查法
 
無菌采集患者及病鳥、畜的生物材料，包括血液、病變臟器、流產(chǎn)胎兒及各種分泌物制片。將所采病料（肝、肺、脾）表面火焰消毒后，從其內(nèi)部無菌取樣，涂片，用Giemsa染色，可見EB呈現(xiàn)紅色，RB呈藍紫色。用Stamp氏法染色，結(jié)果是在淡綠色背景的襯托下，衣原體呈現(xiàn)鮮紅色。碘染色（Rice）法時，低倍鏡下，沙眼衣原體的包涵體由于含有糖原而呈現(xiàn)棕褐色，鸚鵡熱衣原體的包涵體由于不含有糖原不被著色。在熒光顯微鏡下檢查，可見亮綠色邊界清晰的圓形顆粒，柱狀細胞內(nèi)可見亮綠色包涵體。電鏡下，可以見到圓形或卵圓形顆粒，中央核心電子密度大，是EB；個體較大，中央核心電子密度低的為RB。
 
2、細胞培養(yǎng)法
 
常見有兩種方法，一種是利用HeLa229細胞或McCoy細胞等進行分離培養(yǎng)，另一種則是通過雞胚卵黃囊接種培養(yǎng)，隨后均經(jīng)過姬姆薩染色或熒光染色，最終利用顯微鏡鑒定包涵體。
 
細胞分離培養(yǎng)一直被視為衣原體檢測的標(biāo)準(zhǔn)方法。該法的敏感性顯著高于雞胚培養(yǎng)法，而且某標(biāo)本接種細胞的盲傳培養(yǎng)可提高分離率。衣原體可在多種細胞中增殖、分離或培養(yǎng)最常用是McCoy和L929細胞。其他傳代細胞如BHK21、LF、Vero等傳代細胞均可供選用。用熒光標(biāo)記的抗體、酶結(jié)合的單克隆抗體、碘或姬姆薩氏染色，胞漿中若出現(xiàn)特征性的包涵體，即可考慮存在衣原體。
 
由于絕大多數(shù)衣原體可在5～9d齡雞胚卵黃囊內(nèi)生長繁殖，雞胚卵黃囊接種培養(yǎng)接種用的病料應(yīng)預(yù)先用滅菌肉湯或Hank’s液制成10%的組織懸液，如有雜菌，需在懸液中加入鏈霉素（50mg/ml）和慶大霉素（50mg/ml），4℃下作用4～14h后，離心取上清液接種雞胚卵黃囊，每胚0.3～0.5ml。繼續(xù)培養(yǎng)，棄去前2d死亡的雞胚。一般于接種后5～12d死亡，將死亡雞逐漸形成的卵黃囊自雞胚割離。并將其剪破，無菌生理鹽水沖洗卵黃囊膜，除去卵黃，夾取卵黃囊膜一小塊涂片，染色鏡檢。
 
細胞培養(yǎng)不利的一方面是必需有可以被檢測的感染組織或器官，這就要求采樣后要及時送到實驗室，運輸媒介要合適，不能混有青霉素，保持4℃或者液氮冷凍。
 
（二）血清學(xué)檢測
 
農(nóng)業(yè)部在2002年8月發(fā)布了農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《動物衣原體病診斷技術(shù)》，標(biāo)準(zhǔn)號為NT/T562—2002，并于2002年12月1日正式實施。標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定了鸚鵡熱衣原體病主要采用：①補體結(jié)合試驗（CF）的直接法與間接法；②間接血凝試驗（IHA）技術(shù)。另外，在實際工作中，ELISA實驗也廣泛用于臨床診斷。
 
微量免疫熒光法（MIF）是國際上標(biāo)準(zhǔn)的且是最常用的衣原體血清學(xué)診斷方法，但在鸚鵡熱衣原體做診斷時應(yīng)謹(jǐn)慎，除病人具有病鳥接觸史以外，血清標(biāo)本應(yīng)同時檢測沙眼衣原體、肺炎衣原體和鸚鵡熱衣原體抗體并比較抗體滴度，以滴度最高作為感染的衣原體種，從而確定是否是鸚鵡熱衣原體，這三個衣原體種之間可能存在血清學(xué)交叉反應(yīng)。
 
（三）分子生物學(xué)檢測
 
分子生物學(xué)檢測體系是以基因檢測為基礎(chǔ)，通過對病原體特定基因的分析對該病原體進行定性乃至定量分析的一種檢測體系。核酸雜交是最早應(yīng)用于衣原體診斷的分子生物學(xué)方法�；�于PCR原理的基因檢測技術(shù)由于特異性好、敏感性高，則逐漸成為衣原體分子生物學(xué)診斷的主流方法。
 
國外學(xué)者已成功建立以衣原體的外膜蛋白基因（MOMP、ompA、ompB）、熱休克蛋白、脂多糖基因為靶基因的PCR檢測技術(shù)。其中有普通PCR檢測、多重PCR、RFLP-PCR分析和PCR-ELISA和Real-TimePCR。SYBR Green標(biāo)記與TaqMan探針最常用于Real-timePCR檢測中，檢測靶基因較多采用具有高度種屬特異性的衣原體外膜主蛋白MOMP基因。在臨床檢測中，與傳統(tǒng)的免疫熒光組化分析相比，Real-time PCR表現(xiàn)出較高的特異性，并且其檢測敏感性能達到10-1CFU相當(dāng)?shù)乃�平，使得Real-timePCR有望成為C.psittaci臨床檢測的一個快速、可靠的方法。
 
鸚鵡熱衣原體的鑒定還可以根據(jù)鸚鵡熱衣原體對四環(huán)素族抗生素、紅霉素及螺旋霉素敏感，對慶大霉素、卡那霉素、新霉素、鏈霉素和磺胺嘧啶鈉不敏感的特性進行藥敏試驗。
 
三、環(huán)境與污染源
 
含鸚鵡熱衣原體的分泌物、排泄物、羽毛及塵埃等可污染環(huán)境。禽類及其養(yǎng)殖場、宰殺車間、羽絨加工廠、家禽和鳥類市場或其集散點、轉(zhuǎn)運場地或運輸工具乃至信鴿調(diào)教基地等均可能成為傳染場所。帶菌或發(fā)病的鳥類、家禽、野生水鳥、外觀健康但排菌的鸚鵡、金絲雀等觀賞鳥類是重要的傳染源。城鄉(xiāng)常見的鴿群可能是具有廣泛地區(qū)性的傳染源。帶菌患者咯痰對他人也有傳染性。此外患病流產(chǎn)的牛、羊、豬等也是傳染源。
 
家禽感染與人群發(fā)病關(guān)系的調(diào)查顯示，鴨類多是東歐和俄羅斯人群間的傳染源，火雞次之；美國的人群感染主要來自火雞；西歐各地則以觀賞鳥類中鵝鵡為主，其他如金絲雀及鴿等也是常見的傳染源，偶有從海鳥獲得感染的。