外泌體藥物遞送的相關(guān)基礎(chǔ)研究和工業(yè)發(fā)展的綜述與回顧

外泌體是由細(xì)胞分泌的膜性小囊泡，內(nèi)含豐富的生物活性分子，且具有將生物活性分子運(yùn)輸?shù)绞荏w細(xì)胞的能力，因而在載藥領(lǐng)域被廣泛研究且熱度持續(xù)高走。近期，Tenchov等人檢索并分析了CAS數(shù)據(jù)庫(kù)中外泌體(extracellular vesicles, EVs)在治療和診斷領(lǐng)域中應(yīng)用研究的發(fā)表情況。如圖1所示，有超過4萬(wàn)篇與EV相關(guān)的科學(xué)論文（主要是期刊文章和專利）,其中與EV在藥物傳遞和診斷有關(guān)的論文超過25000篇；且2015年后來自美國(guó)機(jī)構(gòu)的文獻(xiàn)數(shù)量與美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院(NIH)的資助急劇增加，其中，中國(guó)、美國(guó)、韓國(guó)和日本的相關(guān)發(fā)表期刊文章和專利數(shù)量上處于領(lǐng)先地位。

圖1. 基于EV載藥和診斷的研究論文和專利發(fā)表趨勢(shì)及該領(lǐng)域研究經(jīng)費(fèi)與資助項(xiàng)目統(tǒng)計(jì)

本期文章，小編將對(duì)近年來基于EVs的藥物遞送的相關(guān)基礎(chǔ)研究和工業(yè)發(fā)展進(jìn)行簡(jiǎn)單綜述與回顧。

藥物遞送：EV向左，LNP向右？

自上世紀(jì)90年代以來，合成納米顆粒逐漸被應(yīng)用于臨床給藥，以滿足降低藥物副作用和/或提高治療效果的需求。脂質(zhì)納米顆粒(lipid nanoparticles, LNPs)已被證實(shí)是保護(hù)和運(yùn)輸各種藥物或者疫苗的有效載體，也促成了LNPs的臨床轉(zhuǎn)化。其中，脂質(zhì)體作為一種早期具有膜結(jié)構(gòu)的LNPs，在小分子、蛋白肽段和核酸等遞送方面充分展現(xiàn)了其靈活性和高效性。

除了合成的納米載體，外泌體為基礎(chǔ)的載體系統(tǒng)也引起了基礎(chǔ)研究和工業(yè)界相當(dāng)大的興趣。外泌體作為細(xì)胞間通訊的重要信使，它們將生物分子運(yùn)輸?shù)绞荏w細(xì)胞的能力使其在藥物輸送方面極具吸引力。外泌體在大小、形狀和結(jié)構(gòu)上與脂質(zhì)體相似，但具有更復(fù)雜的脂質(zhì)雙分子層，包含多達(dá)數(shù)百種不同的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和碳水化合物類型，以及內(nèi)部貨物和表面相關(guān)分子。雖然與脂質(zhì)體類似，但是外泌體具有更高的膜曲度和膜不對(duì)稱性，被證明更利于與細(xì)胞膜間的相互作用；且外泌體表面豐富的膜蛋白在藥物遞送方面也賦予其更多的可能性�？偟膩碚f，相比于人工合成的納米載體，外泌體在作為遞送載體方面具有諸多優(yōu)勢(shì)。首先，外泌體衍生于細(xì)胞，在藥物遞送結(jié)束后更容易被代謝；其次，外泌體展現(xiàn)了更低的免疫原性，避免引起不需要的免疫反應(yīng)；此外，外泌體可跨越諸如血腦屏障等其他納米載體難以逾越的體內(nèi)屏障。在過去的3到4年間，根據(jù)文章發(fā)表和專利申請(qǐng)數(shù)量，外泌體相比于LNPs在藥物遞送方面的熱度逐年攀升（圖2）。

圖2. 外泌體和LNPs應(yīng)用于藥物遞送的研究進(jìn)展

載藥方法：親本細(xì)胞修飾 or EV工程化
近年來，已經(jīng)有多種外泌體載藥和修飾平臺(tái)的相關(guān)報(bào)道，用于小分子、核酸類以及蛋白肽等藥物分子的裝載。這些遞送系統(tǒng)在靶向性、安全性和藥代動(dòng)力學(xué)方面均表現(xiàn)出了巨大的優(yōu)勢(shì)。目前基于外泌體的遞送平臺(tái)主要分為兩大類（詳見下表1）通過親本細(xì)胞修飾的外泌體工程化

通過親本細(xì)胞修飾的外泌體工程化
采用基因工程、代謝標(biāo)記和外源導(dǎo)入等策略對(duì)親本細(xì)胞進(jìn)行特異性修飾，從而使得這些細(xì)胞分泌的外泌體攜載自己的目標(biāo)分子

外泌體的直接工程化
在分離和收集外泌體后采用孵育、超聲、電穿孔、反復(fù)凍融、擠壓以及脂質(zhì)體融合等技術(shù)，在外泌體表面或者內(nèi)腔修飾和裝載所需藥物或者靶向試劑
 

表1. 不同載藥方法對(duì)比

通過親本細(xì)胞修飾的外泌體工程化
a 基于細(xì)胞基因改造的外泌體工程化
基因工程作為細(xì)胞修飾策略中一項(xiàng)最為成熟的技術(shù)，在外泌體的修飾之中被廣泛應(yīng)用。目前，exoIL-12作為全球首個(gè)完成Ⅰ期臨床的工程化外泌體候選藥物，即是基于Codiak Biosciences公司的engEx™外泌體藥物遞送平臺(tái)開發(fā)成功。該平臺(tái)通過對(duì)親本細(xì)胞的基因改造，從而實(shí)現(xiàn)其來源外泌體的藥物遞送和蛋白表達(dá)，并靶向到特定的組織與器官起到治療作用。Codiak成功篩選到PTGFRN這一幾乎在所有外泌體中均高表達(dá)的蛋白。通過基因工程手段將IL-12和PTGFRN融合表達(dá)，實(shí)現(xiàn)外泌體對(duì)IL-12藥物的高效裝載。該方法實(shí)現(xiàn)了IL-12腫瘤微環(huán)境的定向遞送，增強(qiáng)了IL-12的劑量，并減少IL-12的全身暴露，有效激活人體免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤的免疫反應(yīng)。此外，全球領(lǐng)先的制藥公司阿斯利康也基于NanoFCM平臺(tái)篩選得到了TSPAN14和CD63兩個(gè)骨架蛋白，用于其外泌體載藥平臺(tái)的開發(fā)(詳見往期文章：最新：福流助力Codiak公司外泌體候選藥物exoIL-12進(jìn)入臨床I期)。

此外，來自美國(guó)俄亥俄州立大學(xué)、梅奧醫(yī)學(xué)中心以及中國(guó) 吉林大學(xué)的研究者們對(duì)經(jīng)質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞通過局部瞬間電刺激，促進(jìn)攜帶mRNA和靶向肽的外泌體的大量釋放。與其他外泌體生產(chǎn)策略相比，細(xì)胞局部電刺激穿孔方法使得外泌體產(chǎn)量提高了50倍，攜載的mRNA含量增加了1000倍。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，該mRNA高載量的外泌體可恢復(fù)原位磷酸酶和PTEN缺陷的膠質(zhì)瘤小鼠的腫瘤抑制功能并增加了小鼠的生存率。哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院和加州巴克老化研究所的研究人員通過細(xì)胞中和外泌體中富集的miRNA的序列分析，并結(jié)合RNA結(jié)合蛋白等的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，系統(tǒng)性的闡釋了miRNA分選進(jìn)入外泌體的具體機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)miRNA通過添加特定的核酸序列并與相對(duì)應(yīng)的RNA結(jié)合蛋白識(shí)別，促進(jìn)在外泌體中富集并進(jìn)而調(diào)控受體細(xì)胞功能的可行性�；�于該調(diào)控機(jī)制，作者通過基因工程的方法在不同miRNA上引入該序列，結(jié)果顯示這些miRNA在外泌體中的含量上調(diào)可高達(dá)20倍。該項(xiàng)研究將極大的推動(dòng)外泌體作為核酸類藥物遞送載體的發(fā)展。

b 基于細(xì)胞代謝標(biāo)記的外泌體工程化
代謝標(biāo)記是一種完善的細(xì)胞功能化策略，它規(guī)避了遺傳操作的許多問題�？赏ㄟ^向細(xì)胞培養(yǎng)基中添加非天然代謝物(如氨基酸、脂類、寡核苷酸或聚糖)來劫持細(xì)胞生物合成。這些代謝物被細(xì)胞吸收，并分別整合到細(xì)胞的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、基因以及糖類等物質(zhì)中。因此，外泌體可在其形成和分泌過程中，實(shí)現(xiàn)這些代謝標(biāo)記產(chǎn)物的攜載。美國(guó)塔夫斯大學(xué)研究者們通過細(xì)胞代謝標(biāo)記的方法實(shí)現(xiàn)EVs的工程化改造。研究者們將非天然氨基酸L-azidohomoalanine作為甲硫氨酸的替代品插入到細(xì)胞蛋白之中，以及利用N-azidoacetyl-D-mannosamine糖前體在唾液酸中引入疊氮基團(tuán)。另外，來自廈門大學(xué)楊朝勇教授團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種基于核酸適配體蛋白標(biāo)記以及聚糖代謝標(biāo)記的雙重標(biāo)記策略，實(shí)現(xiàn)了外泌體表面PD-L1糖基化的原位成像，使得其生物學(xué)功能研究成為可能。利用這一策略，首次證實(shí)外泌體表面PD-L1的糖基化是其與PD-1蛋白作用的必要條件，并可參與抑制CD8 T細(xì)胞的增殖。

c 基于細(xì)胞外源導(dǎo)入的外泌體工程化
通過向細(xì)胞中引入外源材料，隨后可以將其包裝于外泌體之中。而該方法一般需要高的納米顆粒濃度和較長(zhǎng)的孵育時(shí)間來最大限度地提升細(xì)胞所負(fù)載的納米顆粒含量，從而提升在外泌體中的載量。例如，德國(guó)細(xì)胞生物學(xué)和神經(jīng)生物學(xué)研究所的研究人員使用0.5 mM超順磁性氧化鐵納米顆粒(SPIONs)與神經(jīng)元細(xì)胞孵育24小時(shí)，以從神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生負(fù)載該納米顆粒的外泌體。Silva等人利用將巨噬細(xì)胞強(qiáng)大吞噬功能這一特點(diǎn)，將巨噬細(xì)胞與氧化鐵納米顆粒和小分子光敏劑孵育，用以產(chǎn)生磁性和光學(xué)響應(yīng)的外泌體。Lee等人則使用膜融合脂質(zhì)體將疏水的有效物質(zhì)運(yùn)送到細(xì)胞質(zhì)膜，將親水物質(zhì)運(yùn)送到細(xì)胞質(zhì)中，進(jìn)而采用該細(xì)胞收獲得到所需的外泌體。有趣的是，研究者們發(fā)現(xiàn)輸送到細(xì)胞的脂質(zhì)含量與可運(yùn)輸?shù)酵饷隗w中的脂質(zhì)含量不成比例。

外泌體的直接工程化
a 基于電穿孔的外泌體工程
早在十年前，牛津大學(xué)Matthew J A Wood教授團(tuán)隊(duì)即采用電穿孔的方式將siRNA裝載于外泌體之中，并采用基因工程的方法將靶向大腦組織的RVG肽段與外泌體高豐度蛋白Lamp2b融合表達(dá)以提升其靶向能力。通過靜脈注射該工程化外泌體，其被特異性地傳遞到大腦中的神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞，并導(dǎo)致特定基因敲除，在阿茲海默癥的治療中發(fā)揮了優(yōu)異的效果。且研究者沒有觀察到該工程化外泌體在其他組織的特異性富集。來自美國(guó)安德森癌癥中心的Raghu Kalluri教授團(tuán)隊(duì)同樣采用電穿孔的方法將siRNA導(dǎo)入到外泌體和脂質(zhì)體中，并首次對(duì)比了這兩種載體在遞送和治療胰腺癌中的優(yōu)劣性。研究發(fā)現(xiàn)外泌體含有可能增強(qiáng)內(nèi)吞作用的跨膜和膜錨定蛋白，從而促進(jìn)其內(nèi)容物的遞送；此外，表達(dá)于外泌體表面的CD47蛋白可有效避免循環(huán)系統(tǒng)中的巨噬細(xì)胞對(duì)其進(jìn)行清除，極大增加了其體液循環(huán)時(shí)間。此外，北卡羅納大學(xué)Cheng Ke教授團(tuán)隊(duì)也通過電穿孔方法在肺細(xì)胞來源的外泌體、HEK293T細(xì)胞來源的外泌體和人工合成的脂質(zhì)體中分別裝載mRNA分子，并比較了三種載體在成為新冠病毒mRNA疫苗的差異。

b 基于超聲/擠壓的外泌體工程化
如何在外泌體中裝載足量的藥物分子，一直是該領(lǐng)域一項(xiàng)亟需解決的瓶頸問題。來自廈門大學(xué)顏曉梅教授和集美大學(xué)陳超翔副教授團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種主動(dòng)載藥的外泌體藥物分子裝載策略，實(shí)現(xiàn)了阿霉素分子的高效且穩(wěn)定的外泌體包封。與被動(dòng)裝載方法相比較，該方法的載藥量提高了10倍以上。通過NanoFCM技術(shù)確認(rèn)了只有脂膜包裹的顆粒具有阿霉素分子的負(fù)載，而其中的主要雜質(zhì)酪蛋白幾乎不含有阿霉素分子。這些發(fā)現(xiàn)也進(jìn)一步激發(fā)了基于脂質(zhì)探針和免疫介導(dǎo)的磁分離技術(shù)，選擇性地去除非脂質(zhì)封閉顆粒和酪蛋白組合的污染物。(詳見往期文章：JEV：牛奶外泌體載藥新突破）

c  基于外泌體+脂質(zhì)體融合載藥
來自于中山大學(xué)和耶魯大學(xué)的研究者們則將脂質(zhì)體與外泌體進(jìn)行融合，在保留外泌體天然活性的同時(shí)，兼具了脂質(zhì)體成熟的高效藥物分子裝載。研究者們首先利用基因工程的方法，在外泌體表面高表達(dá)CD47蛋白，提高其免疫逃逸能力，同時(shí)利用熱敏脂質(zhì)體裝載抗癌藥物，將兩者進(jìn)行融合，用NanoFCM測(cè)定融合效率高達(dá)95.7%。這種策略構(gòu)建的工程化外泌體既能避免被機(jī)體免疫清除，同時(shí)又高效裝載了治療藥物。(詳見往期文章：NanoFCM助力新型抗癌藥物研發(fā)）

外泌體藥物遞送的工業(yè)發(fā)展
外泌體在藥物遞送方面所展現(xiàn)的巨大潛能，使得其日漸成為工業(yè)界的寵兒。大量涉及大型制藥公司的交易表明，制藥行業(yè)正在將外泌體作為一種克服目前核酸療法難以運(yùn)輸至某些組織的手段。

僅在2020年6月份，禮來、武田和拜耳就宣布了涉及外泌體科技公司的超過10億美元的交易。此外，近年來涌現(xiàn)了幾家新公司，專注于開發(fā)治療性外泌體，作為蛋白、基因和RNA治療等的傳遞載體。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，近些年涌現(xiàn)出來的外泌體領(lǐng)域相關(guān)的新興創(chuàng)業(yè)公司有近100家。位于美國(guó)馬薩諸塞州劍橋市的Codiak BioSciences是第一家把工程化外泌體療法推向人體臨床試驗(yàn)的單位，這家公司有兩款產(chǎn)品進(jìn)入臨床試驗(yàn)：一項(xiàng)是exoSTING在外泌體的腔內(nèi)裝載了STING（一類干擾素IFN的刺激基因）激動(dòng)劑用于治療晚期實(shí)體瘤；另一項(xiàng)exoIL-12則是將外泌體進(jìn)行工程化修飾，使其在表面展示IL-12，用于治療早期皮膚T細(xì)胞淋巴瘤。雖然Codiak公司已于今年3月申請(qǐng)破產(chǎn)，但它作為外泌體行業(yè)先驅(qū)，為外泌體大規(guī)模生產(chǎn)、純化工藝和表征質(zhì)控等行業(yè)難題的解決，奠定了重要的基礎(chǔ)，對(duì)外泌體行業(yè)的貢獻(xiàn)不言而喻。

除了生物科技公司和藥企巨頭之外，近兩年來眾多的供應(yīng)商也持續(xù)發(fā)力，頻頻達(dá)成多個(gè)重磅戰(zhàn)略合作。CDMO全球霸主LONZA集團(tuán)先后收購(gòu)了Exosomics的服務(wù)單元和Codiak的外泌體生產(chǎn)工廠，積極布局外泌體服務(wù)，已形成意大利Siena、瑞士Basel、美國(guó)得克薩斯州Houston、馬里蘭州Rockville和馬薩諸塞州Lexington等多中心的服務(wù)網(wǎng)絡(luò)。RoosterBio作為行業(yè)領(lǐng)先的MSC和外泌體技術(shù)平臺(tái)供應(yīng)商，分別與賽多利斯、NanoFCM、Univercells及ShiftBio等達(dá)成合作。國(guó)內(nèi)方面，中國(guó)企業(yè)蓄勢(shì)以待，2015年前后中國(guó)外泌體企業(yè)如雨后春筍般紛紛成立，資本更是頻頻出手，多家企業(yè)對(duì)外公布融資情況。

截止目前，納米流式檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)進(jìn)入由中國(guó)研究型醫(yī)院學(xué)會(huì)細(xì)胞外囊泡研究與應(yīng)用分會(huì)圍繞SC-EVs制定的兩項(xiàng)全國(guó)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)中，以及由上海市生物醫(yī)藥行業(yè)協(xié)會(huì)依據(jù)協(xié)會(huì)制定的《間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)》（T/SBIAORG 001-2023）團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)中，期待未來在解決外泌體大規(guī)模生產(chǎn)、純化工藝和表征質(zhì)控的難題，為行業(yè)提供完整的解決方案。

展望
外泌體已被證明其在藥物遞送方面的巨大潛力，且該領(lǐng)域產(chǎn)業(yè)發(fā)展的如火如荼。但是相比于病毒和脂質(zhì)納米顆粒等日趨成熟的遞送載體，外泌體藥物遞送的發(fā)展也才近10年的時(shí)間，外泌體載體的商業(yè)化之路仍然任重而道遠(yuǎn)。這需要更多的臨床相關(guān)系統(tǒng)評(píng)估，并與脂質(zhì)體等替代方案進(jìn)行直接、定量的比較，以全面評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)-效益比。在此過程中，越來越多的新分析技術(shù)有望為外泌體的獨(dú)特性提供新的見解，并可能激發(fā)下一代遞送系統(tǒng)的設(shè)計(jì)與開發(fā)。

參考文獻(xiàn)

1. Kenneth W. Witwer and Joy Wolfram et al., Extracellular vesicles versus synthetic nanoparticles for drug delivery. Nature Reviews Materials, 2021, 6, 103-106.

2. Rumiana Tenchov, Janet M. Sasso, Qiongqiong Angela Zhou et al. Exosomes—Nature's Lipid Nanoparticles, a Rising Star in Drug Delivery and Diagnostics. ACS Nano 2022, 16, 17802−17846.