噬菌體展示文庫構(gòu)建全流程

1.什么是scfv抗體文庫
噬菌體展示文庫是將外源蛋白或多肽與噬菌體外殼蛋白融合，展示在噬菌體表面并保持特定的空間構(gòu)象，利用特異性親和作用以篩選特異性蛋白或多肽的一項新技術(shù)。
Single-chain Fv（scFv）片段由抗體的最小功能性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域 (~30 kDa) 組成，其中可變重鏈 (VH) 和可變輕鏈 (VL) 通過肽接頭連接在一起�？贵w文庫是指將抗體的可變區(qū)（VH和VL）基因，尤其是CDR區(qū)域（互補(bǔ)決定區(qū)）采用不同的策略和方式，如氨基酸突變，移碼讀框等形成數(shù)目龐大的不同克隆，并從這些克隆中篩選出針對目的抗原的高親和力單鏈Fv抗體。 3.scfv抗體文庫優(yōu)點
ScFv 片段保留了親本抗體的結(jié)合特異性，與全長 mAb 相比具有多項優(yōu)勢。
（1）具有藥代動力學(xué)特性，例如更好的組織滲透和快速的血液清除，有利于放射治療和診斷應(yīng)用。例如，與完整抗體相比，這些片段可以更快地滲透到腫瘤中；當(dāng) scFv 在放射治療應(yīng)用中與放射性核素結(jié)合時，它們從血液中清除率增加最大限度地減少了健康組織的暴露。
（2）重組抗體缺少 Fc 區(qū)，導(dǎo)致免疫原性低，因此與全長 mAb 相比，它們在許多應(yīng)用中成為更好的治療劑。
（3）scFv 可以在細(xì)菌和哺乳動物細(xì)胞中克隆和表達(dá)，從而可以輕松且經(jīng)濟(jì)高效地大量生產(chǎn)。
 
4.scfv抗體文庫應(yīng)用
scfv抗體在人類生命科學(xué)發(fā)展歷程中發(fā)揮著重要作用。例如作為工具研究蛋白質(zhì)功能 ，癌癥治療，由于尺寸較小可以與量子點、納米粒子結(jié)合，可以進(jìn)入體內(nèi)定位目標(biāo)，作為運載藥物/納米粒子的載體等。
 
 
5.scfv抗體文庫構(gòu)建服務(wù)的全流程介紹
scfv抗體噬菌體文庫構(gòu)建服務(wù)，流程包括：抗體cDNA制備，基因擴(kuò)增，載體構(gòu)建，電擊轉(zhuǎn)化，抗體鑒定，scfv文庫包裝。 6.1抗體cDNA制備
6.1.1總RNA提取
將外周血淋巴細(xì)胞從冰箱取出后分裝，加入氯仿，離心后取上清加入異丙醇，離心保留沉淀，加入75%乙醇后離心保留沉淀，干燥后加入DEPC水，孵育確保RNA溶解，將各管混合到一管中即為總RNA，取1μl總RNA進(jìn)行電泳，取2μl用核酸濃度測量儀測濃度。
 
6.1.2反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA
按照商業(yè)化試劑盒操作說明書進(jìn)行cDNA制備，將上一步得到的RNA一分為二反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反轉(zhuǎn)錄引物分別用Oligo dTprimer及random 6-mers。
 
6.2 基因擴(kuò)增
首先，以cDNA為模板擴(kuò)增VH和VL(Vκ/Vλ)鏈可變區(qū)，進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)（每個50µl）包含2µlcDNA (40 ng/µl)、1µl正向引物 (10µM)、1µl反向引物 (10µM)、0.5µl Q5 DNA 聚合酶, 1µl dNTP 混合物 (10µM) 和34.5µl dd H₂O.然后，回收 PCR 產(chǎn)物。最后，通過重疊 PCR 連接 VH 和 VL 接頭。 6.3載體構(gòu)建
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物scFv通過酶切連接到噬菌體質(zhì)粒pADL-10b中，從而構(gòu)建含有擴(kuò)增片段的噬菌體質(zhì)粒庫。將連接產(chǎn)物使用DNA純化回收試劑盒按說明書回收，分別取2μl用核酸濃度測量儀檢測回收產(chǎn)物的濃度。
 
6.4電擊轉(zhuǎn)化
6.4.1將連接產(chǎn)物進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化后構(gòu)建含有目的抗體片段的大腸桿菌文庫。
取SS320大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，加入回收后的連接產(chǎn)物，將混合后的感受態(tài)細(xì)胞和連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到預(yù)冷好的電轉(zhuǎn)杯中，使用電轉(zhuǎn)儀預(yù)設(shè)的轉(zhuǎn)化程序電擊轉(zhuǎn)化，電轉(zhuǎn)后立即往電轉(zhuǎn)杯中加入950μlSOC培養(yǎng)基，至少進(jìn)行20個電轉(zhuǎn)。將細(xì)胞復(fù)蘇后涂在含有氨芐抗性的瓊脂糖培養(yǎng)板上過夜生長。將上一步過夜生長后的培養(yǎng)板上的細(xì)胞用2xYT培養(yǎng)基和涂布棒沖洗刮下，加入20%的甘油測OD600nm值后保存在-80℃，即為細(xì)菌文庫。
6.4.2噬菌體文庫擴(kuò)增
將上一步刮下的菌體混勻后轉(zhuǎn)移到100 mL預(yù)先加入四環(huán)素的2x YT培養(yǎng)液中，37℃，250rpm培養(yǎng)直至OD600nm達(dá)到0.5-0.55。
按照輔助噬菌體：細(xì)菌細(xì)胞數(shù)目為20:1的比例加入輔助噬菌體后繼續(xù)37℃培養(yǎng)30分鐘。加入終濃度為50µg/mL的Kana和終濃度為0.2mMI PTG，30℃過夜搖床培養(yǎng)。
6.4.3噬菌體文庫制備
將過夜培養(yǎng)的細(xì)菌4℃ 4000 rpm離心20分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到新的離心管后加入1/4體積預(yù)冷的的20％PEG/2.5M NaCl，在冰上孵育30分鐘。4℃ 4000 rpm離心20分鐘去除上清后加入1 mL PBS緩沖液溶解沉淀。再次加入1/4 體積預(yù)冷的20％PEG/2.5M NaCl后冰上孵育10分鐘，4℃ 12000 xg離心10分鐘后去除上清并將沉淀溶解在1 mL PBS中得到噬菌體庫，長期-80℃保存，短期（1-2周）可于4℃放置保存。
 
6.5抗體鑒定
隨機(jī)挑選20-50個克隆，PCR鑒定陽性率，測序和分析抗體序列。  
 
6.6 scfv文庫包裝
交付＞1x10¹³噬菌體顆粒/ml。
 
自 1988 年推出以來，scFv 在臨床前和臨床應(yīng)用以及研究實驗室中變得高度相關(guān)�？贵w工程的進(jìn)步使高度定制的 scFv 的產(chǎn)生成為可能，這些 scFv 具有改善藥代動力學(xué)的特性，使其更具臨床相關(guān)性。將這些重組抗體與不同粒子偶聯(lián)，擴(kuò)大了它們在診斷、治療和體內(nèi)成像應(yīng)用中的潛力。