淺談納米抗體與嵌合抗原受體T細(xì)胞療法

1989年，研究人員在駱駝的血液樣本中發(fā)現(xiàn)了一種具有特殊功效的重鏈抗體，其可變區(qū)域擁有與抗原的完全結(jié)合的特點(diǎn)。為此，Ablynx公司研制出一種只包含VHH片段的抗體，該抗體尺寸極為細(xì)小，進(jìn)一步引出了納米抗體（Nanobody）的學(xué)術(shù)概念。

圖1 納米抗體

納米抗體具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和功能，例如強(qiáng)大的穿透性、穩(wěn)定性和良好的水溶性，因此在疾病治療、診斷和物質(zhì)檢測(cè)等領(lǐng)域受到了廣泛關(guān)注。由于納米抗體的體積較小，且缺乏抗體保守區(qū)域，因此，在進(jìn)行生物學(xué)分析時(shí)，面臨著更大的挑戰(zhàn)。本文將深入探討納米抗體的結(jié)構(gòu)、功能、藥代動(dòng)力學(xué)特征，并提出一種新的、具有通用性的ELISA系統(tǒng)（USCE），可以在不需要使用特異性試劑的情況下，快速、準(zhǔn)確地建立一種靈敏的ELISA方法，從而大大減少了早期研發(fā)中生物分析的開(kāi)發(fā)難度。

一、納米抗體結(jié)構(gòu)和功能介紹

根據(jù)圖2，納米抗體具有多種結(jié)構(gòu)特征，這些特征與其功能密切相關(guān)，簡(jiǎn)而言之，它們的結(jié)構(gòu)和功能特征如下：

（1）體積�。ǚ肿恿啃。�：由于其結(jié)構(gòu)僅包含重鏈可變區(qū)，使得該物質(zhì)具有分子量極低（~15kd），這使得其具有更強(qiáng)的組織穿透性，并且在藥物性能上具有極大的潛力。近年來(lái)隨著心腦血管、癌癥的患者越來(lái)越多，抗體藥物展現(xiàn)出巨大的發(fā)展前景，針對(duì)不同的靶點(diǎn)，各個(gè)生物公司研發(fā)出不同的抗體藥物用以治療相應(yīng)的病癥，如治療腫瘤微血管生成的貝伐珠單抗，（Cat：TKYR1001），羅氏公司研發(fā)的治療淋巴瘤的利妥昔單抗（Cat：TKYR1004）等。2018年9月，EMA批準(zhǔn)比利時(shí)生物技術(shù)公司Ablynx申請(qǐng)上市的全球首款納米抗體藥物caplacizumab（Cat：TKYR1265）。Caplacizumab是一個(gè)抗von Willebrand 因子（vWF）納米抗體，用于治療一種叫做獲得性血栓性血小板減少性紫癜（aTTP）的罕見(jiàn)病，為納米抗體藥物的研發(fā)開(kāi)啟了新的征程。

圖2. 納米抗體基本結(jié)構(gòu)以及和單抗的比較

（2）具備CDR1, CDR2, CDR3（Complementarity-determining region）互補(bǔ)決定區(qū)，和骨架區(qū)域FR （framework region），如圖3。在FR2區(qū)域，具有高度保守的親水性氨基酸，而在IgG 重鏈可變區(qū)（VH），則具有更高的保守性，其上的氨基酸更加親水/更小，如F42 or Y42、 E49、 R50 and G52和 R50 and G52。由于疏水相互作用的存在，IgG VH和vl之間形成了6個(gè)CDR區(qū)域，從而使得它們能夠穩(wěn)定地結(jié)合在一起，而VHH的親水性則有助于它們?cè)趩误w狀態(tài)下保持穩(wěn)定，避免了聚集的可能性。然而，當(dāng)IgG VL VH濃度較高時(shí)，也會(huì)出現(xiàn)聚集和錯(cuò)配的情況。

圖3. IgG VH和重鏈抗體VHH的CDR和FR區(qū)域示意圖

（3）相比于IgG，納米抗體VHH的CDR3區(qū)域更加寬闊，這樣就能夠填補(bǔ)VL domain的不足。CDR3區(qū)域的寬度決定了納米抗體VHH的特異性，同時(shí)也保證了其與抗原之間的強(qiáng)結(jié)合。此外，納米抗體還能夠延伸至一些常規(guī)抗體無(wú)法到達(dá)的表位（epitope）。

（4）納米抗體VHH其內(nèi)部存在環(huán)間二硫鍵，這些額外的二硫鍵幫助其在惡劣環(huán)境中仍然可以維持構(gòu)象的穩(wěn)定，納米抗體往往相對(duì)常規(guī)抗體更耐高溫，酸堿pH或有機(jī)溶劑。

（5）納米抗體易在細(xì)菌、酵母、真菌等微生物系統(tǒng)中進(jìn)行體外原核/真核細(xì)胞的表達(dá)擴(kuò)增，從而能夠以較低的成本進(jìn)行大量生產(chǎn)。泰克生物建立了一套完整的蛋白表達(dá)，蛋白發(fā)酵，蛋白小試與中試規(guī)模的工藝技術(shù)支持�？梢蕴峁�原核表達(dá)、酵母表達(dá)、哺乳動(dòng)物表達(dá)、昆蟲表達(dá)等多種表達(dá)系統(tǒng)，泰克生物制備納米抗體使用哺乳動(dòng)物表達(dá)體系，包括但不限于FreeStyle 293-F cell line和Expi CHO-S等細(xì)胞系，配合泰克生物設(shè)計(jì)的高表達(dá)載體（含有全長(zhǎng)的CMV啟動(dòng)子以及優(yōu)化后的分泌信號(hào)肽序列）進(jìn)行重組抗體表達(dá)與制備。

納米抗體是一種由駱駝科動(dòng)物產(chǎn)生的抗原結(jié)合物，其可變區(qū)域可以是VHH，也可以是Ig-NAR（new antigen receptor），甚至可以是variable new antigen receptor，它們都是抗原結(jié)合物中最小的形式，如圖4所示。其僅含有CDR1和CDR3，而且分子量極低（~12kd）。

圖4. IgG，駱駝科動(dòng)物產(chǎn)生的重鏈抗體和鯊魚等軟骨魚類產(chǎn)生的IgNAR抗體比較

二、納米抗體的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)及優(yōu)化策略

由于結(jié)構(gòu)上的相似性，納米抗體單體之間在ADME特征上存在一定的共性，如圖5所示，二者之間具有一些共同的特征，可以用來(lái)指導(dǎo)抗體的應(yīng)用。

圖5. 納米抗體單體ADME特征總結(jié)

通常來(lái)說(shuō)，納米抗體的吸收具有非線性藥代動(dòng)力學(xué)特征，血漿藥物達(dá)到峰值后迅速下降（IV,SC）。IV給藥的Cmax呈線性增加，而AUC則呈非線性增加，且增加幅度低于劑量比例。納米抗體通常存在于血液循環(huán)中，如腎臟和肝臟。其代謝和排泄主要通過(guò)腎臟進(jìn)行，但也可能通過(guò)肝臟或ADA介導(dǎo)的方式進(jìn)行。

盡管納米抗體具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，但也存在明顯的缺陷，為了滿足藥物性能的需求，納米抗體結(jié)構(gòu)的優(yōu)化通常會(huì)從以下幾個(gè)方面進(jìn)行：

人源化：VHH抗體是一種來(lái)自全駱駝的抗體，其免疫原性很強(qiáng)，所以通常需要經(jīng)過(guò)人工處理。然而，完全人工處理后的VHH抗體會(huì)將FR2區(qū)域的親水氨基酸轉(zhuǎn)化為疏水氨基酸，這會(huì)導(dǎo)致溶解度和穩(wěn)定性的問(wèn)題。因此，通常需要對(duì)VHH抗體進(jìn)行部分人工處理，以保留FR2區(qū)域的親水氨基酸，這樣的VHH抗體的免疫原性較弱，溶解度和穩(wěn)定性也更好。

二聚/多聚化：通過(guò)二聚或多聚化，納米抗體可以針對(duì)不同的靶蛋白，甚至是同一種蛋白的不同表位，從而提供更多的治療機(jī)制，并且延長(zhǎng)其半衰期。

偶聯(lián)半衰期延長(zhǎng)物（half-life extender）：通過(guò)設(shè)計(jì)特定的蛋白質(zhì)偶聯(lián)，或者針對(duì)HAS的血清白蛋白，可以顯著延長(zhǎng)VHH單體的半衰期，從而提高其生物學(xué)功能。這種方法通常被用于治療糖尿病，如血糖異常、糖尿病腎病等。

小結(jié)

納米抗體具有顯著的優(yōu)勢(shì)，如體積小、穿透力強(qiáng)、穩(wěn)定性好、水溶性好等，因此在治療疾病、診斷和物質(zhì)檢測(cè)等領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注。近年來(lái)，通過(guò)多種修飾手段，納米抗體的應(yīng)用范圍得到了進(jìn)一步拓展，其成藥性、生物檢測(cè)等方面的優(yōu)勢(shì)和劣勢(shì)也得到了明顯的體現(xiàn)。