DAP-seq技術(shù)在ZmEREB57調(diào)控OPDA合成提高玉米耐鹽性研究中的應(yīng)用

茉莉酸類化合物（JAs）是植物中普遍存在的一類植物激素，在非生物脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用。12-氧-植物二烯酸（OPDA）可通過α-亞麻酸（ALA）代謝途徑合成JA，是一種重要的JA前體分子。APETARA2/乙烯響應(yīng)因子（AP2/ERF）轉(zhuǎn)錄因子是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，對(duì)于調(diào)控植物發(fā)育、病原體防御和脅迫響應(yīng)至關(guān)重要。一些ERF家族成員能夠響應(yīng)植物激素和非生物脅迫信號(hào)，然而，關(guān)于單子葉植物（如：玉米、水稻）JA合成與功能的研究較少。

2023年6月16日，濟(jì)南大學(xué)生物科技與技術(shù)學(xué)院李慧教授團(tuán)隊(duì)的研究成果，發(fā)表在植物學(xué)領(lǐng)域的TOP期刊Plant, Cell & Environment，文章題目為“ZmEREB57 regulates OPDA synthesis and enhances salt stress tolerance through two distinct signalling pathways in Zea mays”。該期刊的影響因子為7.947。該研究使用DNA親和純化測(cè)序(DAP-seq)技術(shù)鑒定了玉米中一個(gè)AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合基序以及靶基因。揭示了ZmEREB57通過兩個(gè)不同的信號(hào)途徑調(diào)控玉米OPDA合成增強(qiáng)耐鹽性的分子機(jī)制，為耐鹽性植物新品種的培育提供了重要的遺傳資源。
 

本研究通過轉(zhuǎn)錄組分析篩選了與鹽脅迫相關(guān)的差異表達(dá)基因(DEGs)。其中Zm00001eb193060在鹽脅迫條件下顯著上調(diào)表達(dá)，該基因編碼乙烯響應(yīng)元件結(jié)合因子57 (ZmEREB57)，是一個(gè)AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族成員，定位于細(xì)胞核，并具有轉(zhuǎn)錄激活活性。定量PCR實(shí)驗(yàn)表明，ZmEREB57可被多種類型的非生物脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。

為進(jìn)一步鑒定ZmEREB57的生物學(xué)功能，構(gòu)建了ZmEREB57的過表達(dá)株系(OE1和OE2)和突變體株系(zmereb57-1和 zmereb57-2)。與野生型(WT)相比，2個(gè)zmereb57株系對(duì)鹽脅迫更加敏感，表現(xiàn)為明顯的葉片枯萎和褪綠，葉片含水量和葉綠素含量顯著下降；而2個(gè)OE株系表現(xiàn)出更好的耐鹽性。這表明ZmEREB57參與了玉米的鹽脅迫響應(yīng)。此外，過表達(dá)擬南芥株系 (At-OE1、At-OE2、At-OE3)和突變體株系(atora47，ZmEREB57在擬南芥中的同源基因)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與在玉米中類似，而且回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)還表明過表達(dá)ZmEREB57可以部分恢復(fù)atora47突變體的表型。以上結(jié)果表明，過表達(dá)ZmEREB57增強(qiáng)了玉米和擬南芥對(duì)鹽脅迫的耐受性。
 

通過DAP-seq分析，鑒定了ZmEREB57的特異性核心結(jié)合序列CCGNCC (屬于O-box樣基序)和606個(gè)潛在的靶基因。其中，丙二烯氧化物環(huán)化酶2（ZmAOC2）顯示出強(qiáng)烈的富集峰。酵母單雜交（Y1H）、熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)、凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)（EMSA）進(jìn)一步驗(yàn)證了ZmEREB57直接與ZmAOC2的啟動(dòng)子結(jié)合。在鹽處理?xiàng)l件下，ZmEREB57的過表達(dá)促進(jìn)了ZmAOC2的表達(dá)。
 

采用DAP-seq技術(shù)鑒定ZmEREB57的結(jié)合基序和靶基因

AOC定位于葉綠體，可催化13-過氧化氫亞麻酸形成OPDA，而后在過氧化物酶體中將其轉(zhuǎn)化為JA。zmaoc2突變體實(shí)驗(yàn)表明，在對(duì)照處理組中zmaoc2株系的OPDA和JA含量均低于WT株系（B73），在鹽處理后zmaoc2株系與WT株系之間的OPDA和JA含量差異更大。這說明ZmAOC2參與了玉米OPDA和JA的合成。而且在鹽處理?xiàng)l件下，ZmEREB57-OE株系的OPDA和JA含量增加最多，其次是WT，最后是zmereb57株系。這表明ZmEREB57通過調(diào)控ZmAOC2的表達(dá)來影響內(nèi)源性O(shè)PDA和JA的積累。外源OPDA處理后，WT和zmereb57植株中OPDA和JA水平均有顯著升高；外源JA處理后，植株中OPDA水平僅略有升高，JA水平顯著升高。此外，還發(fā)現(xiàn)外源OPDA或JA的應(yīng)用可以通過增加內(nèi)源OPDA和JA水平來幫助恢復(fù)zmereb57突變體的耐鹽表型。

為進(jìn)一步探討OPDA/JA通路調(diào)控的基因在玉米鹽脅迫下的表達(dá)模式，對(duì)鹽脅迫處理以及OPDA或JA處理的WT植株進(jìn)行了RNA-seq分析。分別篩選不同處理?xiàng)l件下的DEGs，并進(jìn)行KEGG和GO富集分析，發(fā)現(xiàn)主要富集在與脅迫相關(guān)的各種生物途徑中。隨后，還對(duì)若干與鹽脅迫相關(guān)的DEGs開展了RT-PCR驗(yàn)證。結(jié)果表明OPDA或JA處理引發(fā)的玉米轉(zhuǎn)錄組變化，參與了植物對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)。
 

玉米對(duì)鹽和植物激素處理的整體轉(zhuǎn)錄組分析

值得注意的是，OPDA或JA處理后，玉米中的基因表達(dá)模式存在顯著差異。1351個(gè)基因（O&NRGs）對(duì)OPDA和NaCl有特異性反應(yīng)，但對(duì)JA沒有反應(yīng)；2933個(gè)基因（J&NRGs）對(duì)JA和NaCl有特異性反應(yīng)，但對(duì)OPDA沒有反應(yīng)。對(duì)O&NRGs和J&NRGs展開進(jìn)一步的KEGG分析，主要富集到植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和MAPK信號(hào)通路等與非生物脅迫響應(yīng)有關(guān)的途徑中。因此，推測(cè)OPDA具有獨(dú)立的鹽脅迫響應(yīng)機(jī)制。于是采用2個(gè)玉米JA合成突變體：zmaoc2（不能合成OPDA和JA）和zmopr3（JA生物合成缺陷）來驗(yàn)證這一假設(shè)。zmaoc2和zmopr3株系均表現(xiàn)出更強(qiáng)烈的鹽脅迫敏感性。在鹽處理下添加外源OPDA時(shí)，zmaoc2和zmopr3的表型與WT相似。在鹽處理下添加外源JA時(shí)，僅zmopr3的表型與WT相似，而zmaoc2比zmopr3和WT對(duì)鹽脅迫更加敏感。

后續(xù)，選擇3個(gè)O&NRGs基因（ZAT10、ERF9、DREB1）和1個(gè) J&NRGs 基因（VSP9a）進(jìn)行分析，探究鹽脅迫下OPDA的響應(yīng)機(jī)制。在對(duì)照條件下，4個(gè)基因在WT、zmaoc2 和zmopr3中的表達(dá)沒有明顯差別；在鹽處理?xiàng)l件下，4個(gè)基因在zmaoc2中表達(dá)水平顯著低于WT中；在鹽脅迫下添加OPDA時(shí)，增強(qiáng)了WT、zmaoc2 和zmopr3中ZAT10、ERF9和DREB1的表達(dá)；在鹽脅迫下添加OPDA和JA時(shí)，WT和zmaoc2中VSP9a明顯上調(diào)表達(dá)，而添加OPDA時(shí)僅僅是輕微的誘導(dǎo)表達(dá)。這說明OPDA可以通過一種不依賴于JAs的機(jī)制，作為玉米鹽脅迫響應(yīng)的信號(hào)中介。
 

ZmEREB57在鹽脅迫響應(yīng)中的調(diào)控機(jī)制模型

小結(jié)：本研究揭示了ZmEREB57正向調(diào)節(jié)玉米耐鹽性的分子機(jī)制。鹽脅迫誘導(dǎo)了ZmEREB57的表達(dá)，ZmEREB57通過與ZmAOC2啟動(dòng)子中的O-box樣元件結(jié)合，激活其表達(dá)。進(jìn)而通過兩個(gè)獨(dú)立的信號(hào)途徑調(diào)控OPDA和JA的生物合成（OPDA可以直接通過不依賴COI-1的途徑，或者間接地通過依賴JA-COI1的途徑調(diào)控脅迫相關(guān)基因的表達(dá)），增強(qiáng)玉米對(duì)鹽脅迫的耐受性。該研究為玉米、擬南芥和其他植物的耐鹽性新品種培育提供了重要的遺傳資源。

參考文獻(xiàn)：Zhu J, Wei X, Yin C, Zhou H, Yan J, He W, Yan J, Li H. ZmEREB57 regulates OPDA synthesis and enhances salt stress tolerance through two distinct signalling pathways in Zea mays. Plant Cell Environ. 2023 Jun 16. doi: 10.1111/pce.14644.

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