拉伸導致細胞應激和原代羊膜細胞中Nrf2下調的機制

早產(chǎn)現(xiàn)象是造成新生兒發(fā)病與死亡的主要原因，早產(chǎn)占所有分娩數(shù)的5%-15%。在正常妊娠期間，胎膜（由外層的平滑絨毛膜和內(nèi)層的羊膜組成）必須保持完整性，直至分娩。雖然胎膜常在分娩時破裂，但在此之前，生物化學和生物物理變化被認為會減弱胎膜。膜破裂前可見的生化變化包括炎癥和氧化應激，它們在膜弱化中起到很大的作用。子宮內(nèi)氧化應激累積會加速炎癥的積累，導致細胞外基質成分降解，從而導致胎膜變?nèi)酢Ｗ鳛檠趸瘧�激和炎癥的誘導劑，拉伸力在胎膜弱化過程中也很重要。

盡管與分娩相關的研究較少，但轉錄因子NFE2相關因子2（Nrf2）是一種參與調節(jié)DNA轉錄、細胞存活和炎癥調節(jié)的蛋白質復合物。Nrf2已成為抗氧化反應中的關鍵轉錄因子，并與氧化應激相關的毒性和慢性疾病有關。雖然已知Nrf2可由ROS和細胞應激激活，但過度的應激條件（如膿毒性休克和高水平的氧化應激）會矛盾地損害Nrf2的表達，導致炎癥和組織損傷增加。已證明Nrf2缺乏與核因子-kB（NF-kB）介導的炎癥有關。然而，Nrf2也隨分娩而降低，其活化會降低細胞因子IL-6的表達。但是目前，拉伸對Nrf2活性的影響尚未在胎膜的羊膜細胞中專門探索。由于高水平的氧化應激和增加的炎癥與胎膜的減弱有關，因此Nrf2的作用，特別是其下調，與此有關。

基于此，在美國夏威夷大學馬諾阿分校醫(yī)學院解剖學、生物化學與生理學系，韋恩州立大學醫(yī)學院等團隊的一項研究中，旨在確定體外拉伸對羊膜上皮細胞應激和Nrf2的影響。實驗假設體外拉伸會誘導細胞應激反應，激活促炎介質；ROS，HMGB1和NF-kB，同時下調Nrf2。 由于其在細胞保護中的作用，闡明體外拉伸對Nrf2的影響可以深入了解其在胎膜中的作用。




拉伸誘導細胞應激反應

前期已經(jīng)證明對人羊膜上皮細胞（hAECs）的拉伸可以增加促炎細胞因子的產(chǎn)生，因此實驗進一步表征了由這種刺激誘導的hAECs的細胞反應。體外拉伸裝置設置為20% 的循環(huán)拉伸和釋放實驗持續(xù)4、8和16小時，間隔27秒拉伸幅度為20%，然后將拉伸釋放7秒至0%。乳酸脫氫酶（LDH）活性的速率是細胞應激的非特異性標志物。結果表明，拉伸4 h顯著提高了LDH活性（圖1 A）。由于LDH數(shù)據(jù)提供了拉伸引起細胞應激的證據(jù)，因此研究了拉伸對危險相關分子模式分子HMGB1的直接影響。在hAEC拉伸4 h 的條件培養(yǎng)基中，HMGB1分泌量顯著增加（圖1 B）。由于hAECs顯示細胞在拉伸后變得應激，因此通過用免疫熒光測量NF-kB p65亞基易位到細胞核來測量其對促炎NF-kB級聯(lián)反應的影響。結果發(fā)現(xiàn)，hAEC拉伸4 h 顯著增加了NF-kB p65亞基核易位（圖1 C）。
（A）動力學測量的LDH活性（mU/μL）隨著拉伸而增加。（B）ELISA定量拉伸4小時和未拉伸hAECs的細胞培養(yǎng)上清液HMGB1（ng/μL）的含量。（C）hAECs中p65蛋白核定位的免疫熒光分析。（i,ii）對照原代羊膜上皮細胞的DAPI-藍（1μg/ mL）和p65（1/500）染色。（iv,v）分別對拉伸的原代羊膜上皮細胞進行DAPI和p65染色。（iii,vi）分別合并了對照細胞和拉伸細胞的 DAPI 和 p65 信號。


Nrf2在人胎膜細胞中表達，并在hAEC分離和細胞培養(yǎng)后保持表達

Nrf2水平已被證明隨著分娩在胎膜中降低。因此，實驗使用模型系統(tǒng)研究拉伸對Nrf2表達的影響，試圖確定在人類胎膜收集期的基礎表達水平是否足夠高，以便研究其調節(jié)機制。對收集的胎膜組織的定性免疫組織化學分析顯示， 與 IgG（對照）染色相比，Nrf2在羊膜、絨毛膜和蛻膜細胞中表達強烈（圖2 A）。在羊膜中，羊膜間充質細胞（hAECs）的Nrf2表達信號相對強于對照組（圖2 C、D）。然而，hAEC和hAMC Nrf2信號都具有強大的核表達。然后，在收集的羊膜細胞中確認了Nrf2在基因水平上的表達，并將其與HeLa污染的羊膜上皮樣細胞（WISH），胎盤組織和hAMCs中的Nrf2表達進行了比較（圖2 E）。此外還測量了hAMCs的表達，因為免疫組織化學發(fā)現(xiàn)這些細胞具有強表達（圖2 A）。hAECs和hAMCs的基因表達水平均低于WISH細胞系，但高于分離的胎盤組織。hAECs的Nrf2表達高于hAMCs。異硫氰酸熒光素（FITC）標記的Nrf2的免疫細胞化學分析進一步證實了細胞分離后 Nrf2 在 hAECs 中的表達（圖2 F-H）。
（A）Nrf2在胎膜中的代表性免疫組織化學圖像，放大倍數(shù)20×Nrf2（B）IgG對照。（C）羊膜層Nrf2和（D）IgG染色組織羊膜層IgG染色組織。（E）歸一化為GAPDH的Nrf3表達的qPCR分析。（F-H）hAECs中 Nrf2 表達的免疫細胞化學，分別放大 60x FITC標記的 Nrf2、DAPI 染色和合并圖像。


體外拉伸下調人羊膜上皮細胞Nrf2的表達

已經(jīng)確認Nrf2在hAECs 組織和細胞水平上的穩(wěn)健基線表達（圖2 D），因此實驗使用這種羊膜細胞類型來確定機械拉伸對該轉錄因子的影響。hAEC最初進行 20% 的循環(huán)拉伸持續(xù)4、8和16小時。拉伸4 h后，與未拉伸細胞的對照相比，細胞內(nèi) Nrf2的水平顯著降低（圖3 A）。拉伸8和16 h后，Nrf2表達降低，但Nrf2蛋白表達無顯著差異，因為在未拉伸對照條件下，Nrf2表達也降低。由于20%循環(huán)拉伸持續(xù)4 h導致Nrf2表達與對照條件相比顯著降低，因此研究了Nrf2易位到細胞核的影響，結果表明，機械拉伸使細胞核Nrf2表達顯著降低（圖3 B）。這些結果證實了機械拉伸導致Nrf2水平的降低。由于Nrf2在拉伸后被下調，而ROS的產(chǎn)生可以下調Nrf2活性，因此在拉伸后測量了ROS的產(chǎn)生，結果表明，拉伸后Nrf2表達的降低伴隨著ROS產(chǎn)生的增加（圖3 C）。
（A）Nrf2（100 kDa）和β-肌動蛋白（42 kDa）的全細胞裂解物。（B）20% 循環(huán)拉伸4小時后Nrf2（100 kDa）和層粘連蛋白B1（70 kDa）表達的核裂解物蛋白質印跡。（C）通過DCF（nM）量化ROS的生成，其隨拉伸而增加。


蘿卜硫素在拉伸的羊膜細胞中挽救獨立于 ROS 的 Nrf2

蘿卜硫素已被證明在特定的濃度下通過激活Nrf2信號通路能夠引發(fā)一連串抗氧化酶的產(chǎn)生，可有效減輕氧化應激和組織/細胞損傷。由于Nrf2被認為在與早產(chǎn)相關的促炎途徑中發(fā)揮作用，因此對1、2 μM蘿卜硫素處理的細胞進行機械拉伸，以研究其對Nrf2易位和活性的影響。首先，利用LDH活性量化蘿卜硫素處理對細胞毒性的影響。在拉伸或對照條件下，0、1或2 μM蘿卜硫素處理后LDH活性沒有顯著差異（圖4 A）。此外，在hAECs拉伸4 h后，1 μM蘿卜硫素處理提高了57.8% 的核Nrf2水平，而2 μM蘿卜硫素處理導致核Nrf2水平顯著增加122.2%（圖4 B）。由于蘿卜硫素改善拉伸誘導Nrf2下調，因此還研究了其對ROS產(chǎn)生的影響。蘿卜硫素處理對hAECs的ROS產(chǎn)生沒有顯著影響，因為在所有蘿卜硫素濃度下，ROS隨拉伸而顯著增加（圖4 C）。
（A）動力學測量用蘿卜硫素處理的LDH活性。（B）蘿卜硫素處理下核Nrf2蛋白相對于層粘連蛋白B1的表達。（C）用蘿卜硫素處理的DCF生成。
（A-C）轉錄因子Nrf2和NF-kB的激活取決于細胞應激的水平。（A）說明沒有明顯壓力的正常生理狀況。泛素化的Nrf2與KEAP1結合，NF-kB-p65與IkB結合，從而抑制它們易位到細胞核中。（B）中度壓力的影響，例如懷孕的第三個月。Nrf2與KEAP1分離，這允許核易位并與ARE基序特異性基因結合。NF-kB-p65仍然與細胞質中的IkB結合。（C）嚴重的壓力導致分娩和細胞伸伸。升高的應激導致KEAP1-Nrf2復合物的移除和IKKB的激活，從而抑制了IkB的抑制，激活了NF-kB-p65并導致二聚體易位到細胞核中并與RELB基序特異性基因結合。（D、E）人羊膜上皮細胞（D）未拉伸，（E）拉伸20%。拉伸的細胞增加細胞質ROS，HMGB1的分泌和LDH活性。還顯示總Nrf2和核Nrf2減少，核NF-kB-p65增加。


該研究重點是了解了妊娠末期拉伸對胎膜的作用。它是第一個確定機械拉伸對轉錄因子Nrf2表達的影響以及HMGB1分泌和細胞內(nèi)ROS水平變化的，特別是在hAECs中（圖5）。先前的工作表明，拉伸會導致hAECs分泌的IL-6和PBEF增加，因此結合新數(shù)據(jù)，支持了這種形式的細胞應激刺激可以在羊膜中促炎的一般論點。為了進一步支持研究結果，先前已經(jīng)表明，沉默原代羊膜細胞中的Nrf2會增加促炎細胞因子IL-6和趨化因子IL-8的表達和分泌。因此，在該研究中，蘿卜硫素對Nrf2降低的拯救表明，Nrf2的激活可以被操縱來產(chǎn)生抗炎和抗氧化過程，這些過程對及時分娩和健康的妊娠結果很重要。

參考文獻：Padron JG, Norman Ing ND, Ng PK, Kendal-Wright CE. Stretch Causes Cell Stress and the Downregulation of Nrf2 in Primary Amnion Cells. Biomolecules. 2022 May 31;12(6):766. doi: 10.3390/biom12060766. PMID: 35740891; PMCID: PMC9220942.

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