Plant Physiology：DAP-seq在毛白楊干旱脅迫響應(yīng)機制研究中的應(yīng)用

干旱脅迫限制了樹木的生長，并影響其地域性分布。為了應(yīng)對干旱脅迫，植物進化出了一系列的生理生化反應(yīng)機制，以保護植物細胞免受損害。因此，研究干旱脅迫下樹木生理和光合作用變化的分子機制，將有助于培育耐旱性樹木新品種，增強林木的生產(chǎn)力和經(jīng)濟價值。

2023年5月29日，北京林業(yè)大學(xué)生物學(xué)院林木分子育種團隊的研究成果，發(fā)表在知名學(xué)術(shù)期刊Plant Physiology，文章題目為 “Allelic variation in transcription factor PtoWRKY68 contributes to drought tolerance in Populus”。該期刊的影響因子為8.005。該研究使用DNA親和純化測序(DAP-seq) 技術(shù)鑒定了毛白楊轉(zhuǎn)錄因子PtoWRKY68的結(jié)合基序以及靶基因。揭示了PtoWRKY68基因等位變異通過調(diào)控ABA信號通路響應(yīng)干旱脅迫的分子機制，為利用分子育種策略開發(fā)耐旱樹木新品種奠定了遺傳基礎(chǔ)。

該研究利用來自不同自然種群的300份中國白楊材料，對7個干旱相關(guān)性狀進行全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）。與充足水分條件下相比，在干旱條件下植物的水分利用效率（WUE）、ABA水平、脯氨酸水平（PRO）均顯著提高，氣孔導(dǎo)度（Gs）、細胞間CO₂濃度（Ci）、蒸騰速率（Tr）、葉綠素含量（Chl）則顯著下降。在干旱條件下，中國西北（NW）和東北（NE）氣候區(qū)域的干旱相關(guān)性狀變化率明顯高于南部（S）地區(qū)。在全基因組水平上，篩選到最顯著相關(guān)的一個SNP位點，位于Ptom.004G.01096起始密碼子上游1.9Kb（與Gs顯著相關(guān)），該基因編碼WRKY家族轉(zhuǎn)錄因子PtoWRKY68。干旱脅迫下PtoWRKY68的表達水平顯著增加，說明PtoWRKY68可能參與了毛白楊的干旱脅迫響應(yīng)過程。過表達PtoWRKY68提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥（OE-1和OE-3）的耐旱性，這表明PtoWRKY68是一個植物耐旱性的正調(diào)控因子。

圖1. 毛白楊干旱相關(guān)性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析

PtoWRKY68基因序列變異分析，發(fā)現(xiàn)WRKY結(jié)構(gòu)域上游的一個12bp indel和WRKY結(jié)構(gòu)域中的三個非同義變異與Gs顯著相關(guān)�；�于PtoWRKY68基因變異，將毛白楊分為兩個單倍型類群：PtoWRKY68^hap1（已在擬南芥中做了過表達）和PtoWRKY68^hap2。等位基因頻率調(diào)查顯示PtoWRKY68^hap1主要分布在NE和NW區(qū)域，PtoWRKY68^hap2主要分布在S區(qū)域，這與當(dāng)?shù)亟邓�的趨勢相一致，符合楊樹的地理適應(yīng)特征。分析還發(fā)現(xiàn)PtoWRKY68^hap1材料對干旱的響應(yīng)明顯高于PtoWRKY68^hap2材料。然而，在干旱脅迫下PtoWRKY68^hap1和PtoWRKY68^hap2的上調(diào)表達水平相當(dāng)，所以兩個單倍型群體對干旱脅迫響應(yīng)的差異并不是由于PtoWRKY68等位基因表達水平的差異所致。在干旱脅迫下，PtoWRKY68^hap1OE的耐旱性強于過表達PtoWRKY68^hap2的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株（PtoWRKY68^hap2OE），且二者都強于WT。此外，與WT和PtoWRKY68^hap2OE相比，PtoWRKY68^hap1OE中WUE、ABA、PRO的值更高，Gs和Tr的值更低。以上結(jié)果表明PtoWRKY68^hap1對毛白楊耐旱性的進一步提高，可能與等位基因變異對干旱脅迫的不同響應(yīng)有關(guān)，其中PtoWRKY68^hap1和PtoWRKY68^hap2分別為耐旱等位基因和干旱敏感等位基因。

圖2. PtoWRKY68等位基因變異與毛白楊耐旱性顯著相關(guān)

隨后，對充足水分和干旱脅迫條件下的差異表達基因（DEGs）進行共表達網(wǎng)絡(luò)分析。干旱脅迫下在PtoWRKY68^hap1和PtoWRKY68^hap2兩個單倍型群體之間有164個基因的表達存在顯著差異，說明這些基因的表達受到PtoWRKY68等位基因變異的影響。采用DAP-seq技術(shù)分別鑒定了PtoWRKY68^hap1和PtoWRKY68^hap2的核心結(jié)合基序W1-box和W2-box及其靶點。KEGG分析發(fā)現(xiàn)靶基因主要富集于防御反應(yīng)和植物激素信號通路中�；�于DEGs、共表達網(wǎng)絡(luò)分析和DAP-seq分析，篩選到3個與PtoWRKY68等位基因相關(guān)的靶基因：PtoABF2.1、PtoRD26.1、PtoDTX49.1。干旱脅迫下與在PtoWRKY68^hap2材料中相比，在PtoWRKY68^hap1材料中PtoABF2.1和PtoRD26.1的表達量更高，而PtoDTX49.1的表達量更低。因此表明，PtoWRKY68介導(dǎo)了PtoDTX49.1、PtoABF2.1和PtoRD26.1在干旱脅迫下的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

圖3. DAP-seq鑒定PtoWRKY68等位基因潛在的靶基因

基于DAP-seq數(shù)據(jù)中的結(jié)合峰值、熒光素酶報告實驗(DLRA)、凝膠阻滯實驗（EMSA），說明了與PtoWRKY68^hap2相比，PtoWRKY68^hap1對靶基因的啟動子具有更高的親和力。干旱脅迫下與WT和PtoWRKY68^hap2OE相比，在PtoWRKY68^hap1OE中AtABF2和AtRD26的表達水平顯著升高，AtDTX50的表達水平則明顯降低。ABA敏感性實驗說明PtoWRKY68等位基因在ABA依賴的氣孔關(guān)閉中起重要作用。隨后還發(fā)現(xiàn)與PtoWRKY68^hap2材料相比，PtoWRKY68^hap1材料的失水速度較慢、氣孔關(guān)閉速度較快。因此，干旱脅迫下PtoWRKY68^hap1通過增強干旱脅迫信號通路和ABA信號通路以及減少ABA外排，從而增加細胞中的ABA積累，最終增強植物的耐旱性。

數(shù)量性狀位點（eQTL）分析發(fā)現(xiàn)PtoSVP.3受干旱脅迫誘導(dǎo)表達，其表達水平與PtoWRKY68呈正相關(guān)。EMSA和DLRA實驗驗證了PtoSVP.3與PtoWRKY68啟動子區(qū)域的CArG基序結(jié)合，促進PtoWRKY68的表達。因此，提出了調(diào)控楊樹干旱響應(yīng)的分子模塊：PtoSVP.3-PtoWRKY68-PtoDTX49.1/PtoABF2.1/PtoRD26.1。為應(yīng)對干旱脅迫，PtoSVP.3正向調(diào)控PtoWRKY68，PtoWRKY68等位基因通過誘導(dǎo)PtoRD26.1和PtoABF2.1的表達以及抑制PtoDTX49.1的表達，進而調(diào)控ABA信號傳導(dǎo)和積累來增強楊樹的耐旱性。

圖4. PtoWRKY68調(diào)控楊樹耐旱性的分子機制模型

小結(jié)：該研究提出了PtoWRKY68調(diào)控楊樹耐旱性的分子機制模型。在干旱脅迫下，PtoWRKY68等位基因受PtoSVP.3的正調(diào)控，PtoWRKY68^hap1（上圖）等位基因變異增強了其對PtoRD26.1和PtoABF2.1的結(jié)合和激活，并抑制了PtoDTX49.1，從而調(diào)節(jié)ABA外排和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來獲得耐旱性。PtoWRKY68^hap2（下圖）比PtoWRKY68^hap1具有較低的結(jié)合親和力和對下游靶點的激活能力。因此，楊樹PtoWRKY68^hap1材料的抗旱性優(yōu)于楊樹PtoWRKY68^hap2材料。PtoWRKY68調(diào)控模塊的鑒定為深入了解楊樹耐旱性的遺傳基礎(chǔ)提供了新的見解，并為利用分子育種開發(fā)耐旱樹木新品種提供了潛在的靶點。
 

參考文獻：Fang Y, Wang D, Xiao L, Quan M, Qi W, Song F, Zhou J, Liu X, Qin S, Du Q, Liu Q, El-Kassaby YA, Zhang D. Allelic variation in transcription factor PtoWRKY68 contributes to drought tolerance in Populus. Plant Physiol. 2023 May 29:kiad315. doi: 10.1093/plphys/kiad315.

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