小動物活體成像中熒光染料的選擇及應(yīng)用

小動物活體成像技術(shù)（in vivo imaging technology）是利用高靈敏度的光學(xué)檢測儀器直接檢測動物活體體內(nèi)的細(xì)胞活動和基因行為研究的一類技術(shù)，是近年來發(fā)展最快的生命科學(xué)研究方法，是最直接觀察細(xì)胞和分子在體內(nèi)行為的新興技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究的各個領(lǐng)域[1]。

活體動物體內(nèi)光學(xué)成像主要采用生物發(fā)光與熒光發(fā)光兩種技術(shù)。生物發(fā)光是利用熒光素酶報告基因在活體內(nèi)表達產(chǎn)生的熒光蛋白與體外注射的熒光素底物發(fā)生化學(xué)反映產(chǎn)生熒光。而熒光發(fā)光成像技術(shù)是將熒光物質(zhì)或熒光物質(zhì)標(biāo)記的小分子物質(zhì)如基因、細(xì)胞也可是小分子藥物、抗體、納米材料等導(dǎo)入到活體體內(nèi)，通過小動物活體成像系統(tǒng)的激發(fā)光源激發(fā)熒光集團到達高能量狀態(tài)，而后產(chǎn)生波長較激發(fā)光長的發(fā)射光，然后通過高靈敏度制冷CCD鏡頭探測到活體內(nèi)的發(fā)射光。通過活體成像技術(shù)可以觀測活體動物體內(nèi)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移、炎癥的發(fā)生、特定基因的表達和藥物作用效果等生物學(xué)過程。

本期小愛主要為大家介紹小動物活體成像實驗中常用的熒光染料及文獻研究思路！

一、D-熒光素

D-熒光素是螢光素酶的底物，在鎂離子存在下熒光素酶使熒光素與ATP反應(yīng)，發(fā)出黃綠色的光�？膳c小動物活體成像系統(tǒng)配套使用，用于體內(nèi)活體熒光檢測。

應(yīng)用案例：子宮內(nèi)膜癌腹膜轉(zhuǎn)移異種移植模型的研究[2]
 

首先構(gòu)建含IL-37BΔ1-45或NC的CV146/熒光素酶慢病毒載體，感染篩選穩(wěn)定表達的細(xì)胞（ISK-LV-IL37b、Δ1-45和ISK-LV-NC）。然后將穩(wěn)定表達的細(xì)胞腹腔注射到小鼠體內(nèi)建立子宮內(nèi)膜癌腹膜轉(zhuǎn)移模型。
 

飼養(yǎng)38天后，對所有小鼠腹腔注射底物D-熒光素。10分鐘后，小鼠腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉溶液。5分鐘后，使用體內(nèi)成像系統(tǒng)光譜對小鼠進行體內(nèi)生物發(fā)光成像（圖1）。然后處死小鼠，取出器官（肝、肺和腎）進行成像。取部分腫瘤及上述臟器用福爾馬林固定，石蠟包埋，其余冰凍于−80°C進行HE染色、免疫組化染色、免疫印跡。
 

圖1  IL-37b抑制子宮內(nèi)膜癌腹膜轉(zhuǎn)移異種移植瘤模型的研究[2]（abs42017256 D-熒光素）

二、DiR 碘化物

DiR 碘化物是一種親脂性的熒光染料，經(jīng)常用來染細(xì)胞膜和其它脂溶性生物結(jié)構(gòu)。由于DiR的近紅外熒光可以穿透細(xì)胞和組織，因此在小動物活體成像技術(shù)中也經(jīng)常使用。
 

應(yīng)用案例：用DiR標(biāo)記納米膠束，評價膠束的腫瘤靶向性以阻止缺氧腫瘤的耐藥和轉(zhuǎn)移[3]
 

采用薄膜分散法制備殼寡糖（COS）包被、唾液酸（SA）受體靶向的順鉑（CDDP）和一氧化氮（NO）共載體納米膠束（CTP/CDDP），并用DiR標(biāo)記膠束，然后利用體內(nèi)成像系統(tǒng)評價CTP/CDDP/DiR的腫瘤靶向性。如圖2a所示，游離DiR在注射后經(jīng)歷了快速的藥物代謝和血液循環(huán)清除，在腫瘤內(nèi)幾乎檢測不到其熒光信號。DiR標(biāo)記的CTP/CDDP膠束給藥后3h，腫瘤組織內(nèi)可見明顯的熒光，且熒光強度隨時間延長而增強。
 

具有智能靶向性的CTP/CDDP膠束增加了細(xì)胞對CDDP的攝取，增強了對腫瘤的細(xì)胞毒性，但降低了對正常器官或組織的全身毒性。在抗腫瘤機制方面，CTP/CDDP通過下調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子-1α、谷胱甘肽2、多藥耐藥相關(guān)蛋白和基質(zhì)金屬蛋白酶9的表達，減少順鉑外流，抑制腫瘤上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，從而逆轉(zhuǎn)缺氧腫瘤細(xì)胞的耐藥和轉(zhuǎn)移。

圖2 DiR標(biāo)記抗腫瘤納米膠束在小鼠體內(nèi)示蹤腫瘤組織[3]（abs45153692 DiR 碘化物）

此外，用于生物標(biāo)記的Cyanine 7.5（一種發(fā)近紅外熒光的花青素?zé)晒馊玖希┯捎谄錈晒獠ㄩL很長，發(fā)射峰（Em max）大于 800nm，恰好處于肌體組織近紅外窗口I的區(qū)域（肌體的血液，體液和組織此區(qū)域背景熒光弱，而長波長穿透性強），所以Cy7.5的標(biāo)記物也常應(yīng)用于小動物活體體內(nèi)成像。

參考文獻

[1] Ntziachristos V. Going deeper than microscopy：the optical imaging frontier in biology[J]. Nature Methods，2010,7(8):603-614.

[2] Wang X, Wei Z, Tang Z, et al. IL-37bΔ1-45 suppresses the migration and invasion of endometrial cancer cells by targeting the Rac1/NF-κB/MMP2 signal pathway[J]. Laboratory Investigation [2023-06-12]. DOI:10.1038/s41374-021-00544-2.

[3] Chen Y, Fang L, Zhou W, et al. Nitric oxide-releasing micelles with intelligent targeting for enhanced anti-tumor effect of cisplatin in hypoxia.[J].Journal of Nanobiotechnology, 2021(1).DOI:10.1186/S12951-021-00989-Z.