Nature：通過基因編輯獲得具有廣譜抗病性且穩(wěn)產(chǎn)的水稻株系

水稻是世界上最重要的糧食作物之一，是一半人口的主食，生產(chǎn)上常受到稻瘟病、紋枯病等多種病害威脅。由稻瘟病菌引起的稻瘟病每年造成的產(chǎn)量損失可以養(yǎng)活6000多萬人。水稻適用于基因編輯技術(shù)，培育抗病特別是廣譜抗病水稻品種，是實現(xiàn)作物病害綠色防控的有效措施。

2023年6月14日，Nature發(fā)表了華中農(nóng)業(yè)大學李國田教授團隊牽頭完成的題為“Genome editing of a rice CDP-DAG synthase confers multipathogen resistance”的研究論文，該團隊通過篩選病變模擬突變體(LMM)克隆到了“RBL1”廣譜抗病基因，此突變體具有廣譜抗病性但會造成嚴重減產(chǎn)。通過靶向基因編輯RBL1，獲得了rbl1Δ12突變體，并經(jīng)多年田間試驗評估，該突變體具有廣譜抗病性，但不會降低產(chǎn)量。

研究團隊首先從KitaaKe水稻1500多份已全基因組測序的快中子誘變系中，篩選到了稻瘟菌抗性增強的名為rbl1的LMM，但該突變體具有低育性（圖1a-f）。接種稻瘟菌后，與KitaaKe相比，真菌菌絲在rbl1中的傳播受到限制，rbl1表現(xiàn)出ROS的顯著上調(diào)、水楊酸的積累和植物防御相關(guān)基因的激活（補充圖2）。對rbl1植株的分離群體進行遺傳分析和測序，在RBL1基因中發(fā)現(xiàn)了一個29個堿基對(bp)的缺失(LOC_Os01g55360)（圖1j）。蛋白序列分析和遺傳互補實驗證實RBL1是致病基因（圖1k-p）。此外通過組織定量實驗和GUS染色分析可知，RBL1在所有組織中轉(zhuǎn)錄，在葉片中含量最高，且其表達受到稻瘟菌感染的誘導。
 
為鑒定RBL1的生物學功能，通過酵母實驗和脂質(zhì)組學分析，RBL1作為一種完整的膜蛋白，具有CDP-DAG合成酶的功能（圖2 a-c）。利用脂質(zhì)組學技術(shù)在rbl1和KitaaKe水稻中測定CDS1相關(guān)的植物甘油酯代謝途徑上的脂類，相對KitaaKe，rbl1水稻中磷脂酸（PA）和DAG的含量升高，磷脂酰肌醇（PI）和磷脂酰甘油（PG）的水平顯著降低（圖2d）。且磷脂酰肌醇的減少是磷脂改變最顯著的結(jié)果（圖2e）。
為了測試外源性補充磷脂是否可以挽救LMM表型，我們進行了化學互補試驗，觀察到外源添加磷脂酰肌醇的培養(yǎng)基，推遲了rbl1的病斑形成，而磷脂酸加速了的病斑形成(補充圖5a - d)。將呼吸爆發(fā)氧化酶同源蛋白( RBOH ) 抑制劑二亞苯基碘化銨應(yīng)用于rbl1，可以緩解LMM表型(補充圖5e)。
為了測試增加磷脂酰肌醇的含量是否可以挽救LMM表型，研究團隊在rbl1中過表達水稻PIS1（OsPIS1）。與rbl1相比，OsPIS1：：rbl1系中的病斑比例減少（圖）。2f-i），病程相關(guān)（PR）基因的表達量和稻瘟菌抗性降低，但高于KitaaKe（圖2f-j）。同時OsPIS1::rbl1植株的磷脂酰肌醇含量恢復到KitaaKe的80%，PtdInsP和PtdInsP2的含量完全恢復（圖2k）。同樣在rbl1中過表達了磷脂酸磷酸水解酶編碼基因OsPAH2(圖2i)。OsPAH2::rbl1系中磷脂酸含量恢復，PR基因的表達水平僅略有下降，病斑比例和稻瘟菌抗性沒有改變(圖2m - o)。這表明rbl1中磷脂酸水平的升高僅以有限的方式有助于增強免疫力。因此該團隊隨后的研究重點放在磷脂酰肌醇衍生物上。
脂質(zhì)印跡結(jié)果顯示在rbl1植物中膜PtdIns(4,5)P2減少（圖3a，b），為進一步分析真菌侵染過程中PtdIns(4,5)P2在原位的時空變化，研究團隊構(gòu)建了表達PtdIns(4,5)P2生物傳感器的穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因水稻品系。在Kitaake中沿質(zhì)膜均勻分布，但在rbl1中，PtdIns(4,5)P2在質(zhì)膜上的信號微弱，并存在于未知囊泡中（圖3c），蛋白印跡Western blotting結(jié)果和熒光信號顯著降低(圖3d,e)。在稻瘟菌侵染后，PtdIns(4,5)P2迅速響應(yīng)并聚集在侵入型菌絲尖端并侵襲外菌絲膜(EIHM)上（圖3g,h），富集在BIC感染特異性結(jié)構(gòu)中（圖3i），但在rbl1中的細胞質(zhì)未觀察到，BIC形成率僅7.1%，遠低于Kitaake的93.3%。綜合來看PtdIns（4,5）P2在真菌和水稻的相互作用中發(fā)揮重要作用。
rbl1株系具有廣譜抗病性，但產(chǎn)量降低了約20倍，為了平衡抗病性和產(chǎn)量，通過多重基因組編輯來構(gòu)建和篩選編輯株系，發(fā)現(xiàn)12個堿基缺失的rbl1^Δ12株系，表現(xiàn)出微小超敏反應(yīng)樣病變，且產(chǎn)生正常的種子（圖4c，d），對10個稻瘟菌、5個Xoo菌株和2個稻曲病菌的菌株具有抗性（圖4 e-j）。相應(yīng)地，與Kitaake相比，rbl1^Δ12感染稻曲病菌的穎花中真菌毒素水平降低了66.2 % (圖4i )。通過無轉(zhuǎn)基因種子進行大田試驗，在不同地區(qū)低稻瘟菌的水稻產(chǎn)區(qū)種植，評估了多個關(guān)鍵農(nóng)藝性狀，株高、單株分蘗數(shù)、結(jié)實率、千粒重和籽粒產(chǎn)量。除株高外，rbl1^Δ12和Kitaake的所有測量性狀無明顯差異。綜上所述，Kitaake水稻的RBL1^Δ12等位基因具有強大的廣譜抗病性，而不會降低產(chǎn)量。
rbl1^Δ12中缺失的4個氨基酸具有保守性，ROS水平響應(yīng)幾丁質(zhì)與其他水稻類似，此外RBL1基因表達水平顯著降低（補充圖7b-d）。RBL1可回補rbl1^Δ12，但rbl1^Δ12不能回補rbl1（補充圖7j-i），與rbl1^Δ12與Kitaake雜交的F2群體中稻瘟病菌抗性表現(xiàn)也證實了互補結(jié)果，說明RBL1位點以反向劑量調(diào)節(jié)來促進免疫力（補充圖7m-o）。此外研究團隊在兩個水稻品種“日本晴”和“中華11號”中生成了RBL1編輯的株系，稻瘟病菌抗性增強，生長正常，類似于rbl1^Δ12(補充圖9)。
本研究結(jié)果揭示了磷脂代謝與抗病性的關(guān)系，獲得了具有廣譜抗病性但不降低產(chǎn)量的株系，表明了微調(diào)參與感染特異性結(jié)構(gòu)形成的宿主因子是平衡免疫力和產(chǎn)量的策略，為作物抗病研究方向做出重要參考，應(yīng)加大基因編輯技術(shù)對負調(diào)節(jié)因子的改造利用，且對不同的LMM基因和作物具有重要的參考價值。

華中農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)微生物資源發(fā)掘與利用全國重點實驗室、湖北洪山實驗室李國田教授和加州大學戴維斯分校/勞倫斯伯克利國家實驗室Pamela C. Ronald院士為該論文共同通訊作者。李國田教授團隊博士研究生沙干、孫鵬為本論文共同第一作者。西北農(nóng)林科技大學康振生院士、法國波爾多大學Yohann Boutté教授、作物遺傳改良全國重點實驗室郭亮教授、李強教授和謝卡斌教授、江西省農(nóng)業(yè)科學院水稻研究所黃仁良副研究員、農(nóng)業(yè)微生物資源發(fā)掘與利用全國重點實驗室鄭露副教授、深圳華大生命科學研究院丘璨瑜副研究員、山東省農(nóng)科院徐建第研究員、澳大利亞阿德萊德大學Jenny Mortimer教授等國內(nèi)外科研機構(gòu)研究人員參與了合作研究。
 

—— 參考文獻 ——

Sha, G., Sun, P., Kong, X., et al. Genome editing of a rice CDP-DAG synthase confers multipathogen resistance[J]. Nature, 2023, 618, 1017–1023.
 

北大荒墾豐種業(yè)-澤泉科技生物技術(shù)與表型服務(wù)中心是由北大荒墾豐種業(yè)股份有限公司和上海澤泉科技股份有限公司共同建設(shè)的開放式高通量植物基因型-表型-育種服務(wù)平臺。中心建立了基因克隆和載體平臺、作物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)、基因型分析平臺、表型鑒定分析平臺、數(shù)據(jù)分析和利用平臺等現(xiàn)代化生物技術(shù)和信息支持平臺，是定位于為植物科研和作物育種提供植物基因型-表型-育種數(shù)據(jù)分析的科研服務(wù)平臺。
基因編輯服務(wù)+靶向測序服務(wù)方案
為了縮短您的育種進程，提高您的育種成功率，北大荒墾豐種業(yè)-澤泉科技生物技術(shù)與表型服務(wù)中心將為您提供水稻基因編輯服務(wù)。本方案利用基因編輯酶系統(tǒng)編輯供試材料的目的基因，在不改變其他基因的情況下迅速獲取一批目的基因缺失型突變體。解決傳統(tǒng)雜交選育中存在的周期長，基因連鎖等難題。

技術(shù)路線：
 

 

靶向測序服務(wù)
靶向測序技術(shù)主要分為基于多重PCR的靶向基因捕獲技術(shù)（GenoPlexs）和基于液相探針雜交的靶向基因捕獲技術(shù)（GenoBaits）兩種�？赏瓿蓡螛悠�50-5000和3000-40000標記的基因型分析，并達到可設(shè)計區(qū)域覆蓋度高于95%，擴增子均一性高于90%的捕獲效率。
 

應(yīng)用領(lǐng)域：
 

種質(zhì)資源分析	分子標記輔助選擇
分子標記輔助回交改良	全基因組選擇
全基因組關(guān)聯(lián)分析	遺傳圖譜構(gòu)建
QTL定位

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