CDX細(xì)胞系來源的異體移植腫瘤模型構(gòu)建方法及重要應(yīng)用

CDX模型，全稱為細(xì)胞系來源的異體移植腫瘤（Cell line-derived xenograft, CDX）模型，是將體外培養(yǎng)的異源（人源）腫瘤細(xì)胞系移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)而構(gòu)建的腫瘤模型。CDX模型是目前抗腫瘤藥物臨床前藥效學(xué)評價(jià)最常用的體內(nèi)模型之一，在腫瘤學(xué)研究和抗腫瘤藥物研發(fā)過程中有著極大的需求。
 

圖1.CDX模式圖

CDX的發(fā)展歷史
在最初的癌癥藥物開發(fā)早期，缺乏有效模型和缺乏測試藥物的通用平臺是藥物開發(fā)的兩大障礙，而對于評估藥物測試平臺的需求促進(jìn)了腫瘤模型的開發(fā)。1955年到1975年，美國國立癌癥研究所（National Cancer Institute, NCI）啟動了大規(guī)模的體內(nèi)抗癌藥物篩選計(jì)劃，開發(fā)出了最早的體內(nèi)測試模型^[1]。研究人員通過使用3-甲基膽蒽涂抹在DBA/2小鼠皮膚上誘發(fā)白血病，成功構(gòu)建出小鼠白血病細(xì)胞系（L1210和P388）。之后，將小鼠的白血病細(xì)胞系植入健康小鼠腹腔內(nèi)，構(gòu)建得到小鼠腫瘤移植模型，為識別潛在的抗癌藥物提供了快速和可重復(fù)的方法。
 

然而，同源小鼠模型與人類癌癥的相關(guān)性逐漸受到質(zhì)疑。小鼠腫瘤模型無法檢測出所有對人類惡性腫瘤具有潛在活性的化合物，小鼠的藥物代謝與藥物活性也與人類存在差異。因此，異源腫瘤移植模型應(yīng)運(yùn)而生。

具有維持異種移植腫瘤能力的裸鼠的發(fā)展標(biāo)志著許多全球藥物測試項(xiàng)目的關(guān)鍵性變化。1969年，丹麥學(xué)者Rygaard首次成功地將人類結(jié)腸癌腫瘤移植于3只裸鼠體內(nèi)^[2]。1972年第一例通過細(xì)胞系注射構(gòu)建的小鼠CDX模型誕生，與稍早建立的直接來源于患者的PDX模型相比，細(xì)胞系容易獲得，建模難度低，具有快速、高通量和可重復(fù)性等優(yōu)點(diǎn)，更有利于抗癌藥物篩選。

1992年，NCI使用來源于9種不同類型腫瘤（腦，結(jié)腸癌，白血病，肺，黑素瘤、卵巢癌、腎癌、乳腺癌和前列腺癌） 的60位癌癥患者腫瘤細(xì)胞系，引入了一種”disease-oriented”的藥物篩選策略，簡單來說，就是先用人腫瘤細(xì)胞系進(jìn)行高通量體外藥物篩選，再用CDX模型進(jìn)行體內(nèi)驗(yàn)證，這一方法具有細(xì)胞系易獲得、有大量已發(fā)表的文獻(xiàn)關(guān)于其基因組學(xué)、細(xì)胞功能學(xué)及藥效反應(yīng)的數(shù)據(jù)可供參考、建模成本低等優(yōu)勢，在各大實(shí)驗(yàn)室迅速風(fēng)靡起來。

CDX模型的構(gòu)建
1. 動物選擇
構(gòu)建CDX模型時(shí)，我們建議使用4-6周齡的免疫缺陷小鼠（老年鼠腫瘤生長速度通常比年輕小鼠慢[3]）。常用的免疫缺陷小鼠品系有：裸鼠、NOD SCID小鼠、M-NSG小鼠等。一般來說，免疫缺陷最嚴(yán)重的小鼠品系（例如M-NSG）的腫瘤植入率最高，但許多常用的人類腫瘤細(xì)胞系在裸鼠和NOD SCID小鼠上的成瘤性同樣很強(qiáng)。值得注意的是，一些免疫缺陷的小鼠容易在胸腺形成淋巴瘤，因此在長期試驗(yàn)中（超過3個月）應(yīng)謹(jǐn)慎使用。
 

圖2. 南模生物免疫缺陷鼠的品系和異同點(diǎn)

南模生物擁有多種可構(gòu)建CDX模型的免疫缺陷鼠，如裸鼠、NOD SCID小鼠、M-NSG鼠等，其中由我們自主研發(fā)的M-NSG是當(dāng)前免疫缺陷程度最高的小鼠之一，缺失成熟T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞，非常適合作為各類CDX模型移植的宿主小鼠。

2. 細(xì)胞系選擇
在給小鼠注射腫瘤細(xì)胞之前，需要明確所選擇的腫瘤細(xì)胞確實(shí)可在所選免疫缺陷小鼠品系的體內(nèi)形成腫瘤。可通過檢查現(xiàn)有文獻(xiàn)或者瀏覽細(xì)胞供應(yīng)商的網(wǎng)站獲得細(xì)胞系致瘤性的信息，也可以在4-5只小鼠上注射不同細(xì)胞數(shù)進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，下面提供部分細(xì)胞的成瘤信息：

常規(guī)較容易成瘤的細(xì)胞：
Hep-G2（肝癌），Hep2（喉癌），NCI-H460（大細(xì)胞肺癌）， A431（表皮癌），SK-OV-3（卵巢癌），MCF-7，SKBR3（乳腺癌）， A375/B16-F10（人黑色素瘤細(xì)胞），SGC7901（人胃腫瘤細(xì)胞），KB（人口腔表皮樣癌細(xì)胞）

可以成瘤但是比較慢的細(xì)胞：
CNE（鼻咽癌），A549（肺癌）， SPC-A-1（肺腺癌）， HT-29（結(jié)腸癌），BEL-7402（肝癌），MDA-MB-231（乳腺癌），SH-SY5Y（人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞 ） ， U251（人膠質(zhì)瘤細(xì)胞） ， BGC-823（人胃癌細(xì)胞） ，PC-3 （人前列腺癌細(xì)胞）
 

腫瘤細(xì)胞須從信譽(yù)良好的來源獲得，確保細(xì)胞不含病原體，并且確認(rèn)細(xì)胞株的準(zhǔn)確身份（通過STR鑒定），避免細(xì)胞系之間的交叉污染或錯誤識別。進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，始終注意無菌操作以防止感染。常見的感染源是支原體，一種無細(xì)胞壁、高度多形性、的原核細(xì)胞型微生物，對許多抗生素治療具有抗性，并且可以來源于人類（例如，口腔支原體）和動物來源（例如，Acholaeplasma laidlawii）。支原體污染可能會使細(xì)胞出現(xiàn)新陳代謝改變、增殖減慢和染色體畸變等問題，從而影響腫瘤生長和結(jié)果的可重復(fù)性。
 

圖3. 支原體

接種細(xì)胞一般選擇在對數(shù)生長期的細(xì)胞，細(xì)胞密度為80-90%左右為宜。收集細(xì)胞前一晚須換新鮮培養(yǎng)基確保細(xì)胞狀態(tài)良好。接種時(shí)所用細(xì)胞懸液須不含血清。一般皮下瘤接種的細(xì)胞量為1-5×10^6個細(xì)胞/只，接種體積為0.1-0.2mL。如有需要，可以加入基質(zhì)膠加速瘤塊的生成，基質(zhì)膠和無血清培養(yǎng)基（或PBS）的比例為1：1。

南模生物擁有數(shù)百種人源細(xì)胞系，覆蓋大部分癌種，滿足客戶的各類移植需求。此外，南模生物還擁有成熟的基因編輯技術(shù)，可提供人源細(xì)胞系定制服務(wù)。

3. 接種部位
根據(jù)我們構(gòu)建的腫瘤模型類型的不同，接種部位可以分為三大類：皮下接種、原位接種、靜脈接種。原位接種的部位為細(xì)胞系對應(yīng)癌種所在部位，靜脈接種一般選擇尾靜脈、左心室注射。皮下注射有五個主要的皮下部位：側(cè)腹、下背部、上背部（肩胛骨之間）、后腿和乳腺脂肪墊（第四腹股溝乳頭下方）。
 

圖4. 小鼠皮下接種常用位置^[4]

構(gòu)建CDX模型的目的不同直接影響著接種部位的選擇。一般來說，用于研究生物標(biāo)志物或藥物治療構(gòu)建的腫瘤模型，首選部位為側(cè)腹或者下背部，這些區(qū)域生長的腫瘤易于觀察和測量，并且無需鎮(zhèn)靜或麻醉小鼠。接種在上背部（肩胛骨之間）的腫瘤有助于成像研究，例如正電子發(fā)射斷層掃描，腫瘤生長的區(qū)域遠(yuǎn)離非腫瘤組織可以更好的避免非腫瘤組織積累放射性核素并掩蓋腫瘤信號的情況。接種于后腿通常用于涉及外部射線照射的研究。軀干/身體和對輻射敏感的器官可以由鉛屏蔽保護(hù)，只有腿（承載腫瘤）在屏蔽外，暴露在輻射中。乳腺脂肪墊的使用通常限于研究乳腺腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移和藥物治療。

4. 成瘤時(shí)間
皮下接種的細(xì)胞一般會在接種后1-2周左右可見皮下開始出現(xiàn)腫塊，尾靜脈和腹腔接種的細(xì)胞一般也是1周左右成瘤。根據(jù)腫瘤細(xì)胞的特性和接種細(xì)胞的量，一般皮下成瘤的周期為1-2個月。腫瘤不宜生長過大，一般不要超過2000mm³。
 

圖5. 將腫瘤測量值轉(zhuǎn)換為腫瘤體積

如果細(xì)胞接種后超過預(yù)期時(shí)間仍未成瘤，需排查以下原因：
· 細(xì)胞活力：細(xì)胞活力是影響腫瘤形成的重要原因，接種細(xì)胞前須觀察細(xì)胞狀態(tài)，細(xì)胞消化后需用PBS清洗并盡快接種（盡量在半小時(shí)內(nèi)完成）。
· 動物選擇：選擇小鼠周齡不宜過大（一般在4-6周齡，體重16-18g左右）。若裸鼠無法成瘤，建議使用免疫缺陷程度更高的小鼠，如NOD SCID小鼠、M-NSG小鼠。
· 飼養(yǎng)環(huán)境：小鼠生活環(huán)境較差會影響小鼠狀態(tài)，造成小鼠死亡。

南模生物不僅可以提供各類免疫缺陷小鼠和數(shù)百種人源細(xì)胞系，同時(shí)具有豐富的CDX模型（包括皮下成瘤模型、原位移植模型和轉(zhuǎn)移瘤模型）構(gòu)建經(jīng)驗(yàn)，部分案例如下：
 

圖6. A549 肺腫瘤細(xì)胞（A）或Raji淋巴瘤細(xì)胞（B）在不同免疫缺陷小鼠上的成瘤驗(yàn)證。
 

圖7. 基于人結(jié)腸癌細(xì)胞系的顱內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤模型（宿主小鼠：裸鼠）

CDX模型的應(yīng)用

腫瘤生物學(xué)研究
在研究階段，CDX模型作為最便捷的腫瘤研究體內(nèi)模型之一，常用于腫瘤的生物標(biāo)志物篩選、組織病理學(xué)、腫瘤轉(zhuǎn)移以及血液學(xué)分析等研究。

腫瘤藥物研發(fā)
作為腫瘤藥物研發(fā)過程中的黃金標(biāo)準(zhǔn)模型，CDX模型以及時(shí)且經(jīng)濟(jì)高效的方式，提供了推動治療藥物發(fā)展及促進(jìn)臨床前開發(fā)項(xiàng)目所需的關(guān)鍵決策信息。

南模生物可以為您的藥物選擇合適的CDX模型，并提供多種藥理藥效分析服務(wù)，部分?jǐn)?shù)據(jù)如下：

CDX腫瘤模型體內(nèi)藥效實(shí)驗(yàn)
 

圖8. 利用淋巴癌（Raji）CDX模型進(jìn)行抗人CD47抗體藥效驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

CDX腫瘤模型CAR-T療效實(shí)驗(yàn)

圖9. 利用結(jié)腸癌（HCT116）CDX模型進(jìn)行CAR-T及化療聯(lián)合治療藥效驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)
 

圖10. 移植CAR-T的M-NSG小鼠體內(nèi)的GvHD研究。

免疫腫瘤學(xué)研究
人類免疫系統(tǒng)與腫瘤微環(huán)境（TME）的平衡對于腫瘤治療也至關(guān)重要，目前，靶向免疫系統(tǒng)的藥物同樣占據(jù)了很大的腫瘤藥物市場。普通的CDX模型無法很好的模擬人類免疫系統(tǒng)和腫瘤之間的相互作用，因此越來越多的人選擇構(gòu)建免疫系統(tǒng)人源化的CDX模型。

南模生物可通過移植人源外周血細(xì)胞、造血干細(xì)胞等，實(shí)現(xiàn)在小鼠體內(nèi)重塑人源免疫系統(tǒng)。利用huPBMC-M-NSG或huHSC-M-NSG小鼠構(gòu)建的腫瘤模型可滿足腫瘤免疫學(xué)和相關(guān)藥效評估的需求。部分驗(yàn)證數(shù)據(jù)如下：

利用huPBMC-M-NSG模型進(jìn)行藥效評價(jià)

圖11. 利用骨髓瘤（H929）hu-PBMC模型進(jìn)行體內(nèi)藥效研究
 

圖12. 利用乳腺癌（MDA-MB-231）hu-PBMC模型進(jìn)行體內(nèi)藥效研究

經(jīng)過幾十年的發(fā)展，CDX模型目前還是癌癥研究以及抗癌藥物篩選的主要工具之一。但CDX模型存在著無法保留腫瘤的異質(zhì)性、腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為及基因譜表達(dá)水平均與原始腫瘤組織存在較大差異等問題。PDX模型由于其穩(wěn)定保留腫瘤異質(zhì)性、藥物試驗(yàn)結(jié)果具有較好臨床預(yù)見性等優(yōu)點(diǎn)，也逐漸引起研究者的重視，但PDX也存在著建模難度高且不能反復(fù)獲取、構(gòu)建時(shí)間長且成功率不穩(wěn)定、傳代次數(shù)有限等問題�？偟膩碚f，不同的動物模型為研究多種腫瘤的的生物學(xué)特性提供了一個相互補(bǔ)充的系統(tǒng)，我們可以根據(jù)自身需求進(jìn)行選擇。

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References
[1] L.R. Hill, P.T. Tinkey, Chapter 2 - History of Mouse Cancer Models, atient Derived Tumor Xenograft Models, Academic Press. 2017, Pages 15-23, doi:10.1016/B978-0-12-804010-2.00002-3.

[2] Rygaard, J. and Poulsen, C.O. （1969）, HETEROTRANSPLANTATION OF A HUMAN MALIGNANT TUMOUR TO “NUDE” MICE. Acta Pathologica Microbiologica Scandinavica, 77: 758-760. doi:10.1111/j.1699-0463.1969.tb04520.x

[3] Reed MJ, Karres N, Eyman D, Cruz A, Brekken RA, Plymate S. The effects of aging on tumor growth and angiogenesis are tumor-cell dependent. Int J Cancer. 2007;120（4）:753-760. doi:10.1002/ijc.22351

[4] Stribbling SM, Ryan AJ. The cell-line-derived subcutaneous tumor model in preclinical cancer research. Nat Protoc. 2022;17（9）:2108-2128. doi:10.1038/s41596-022-00709-3