蛋白免疫印跡實驗中的轉(zhuǎn)膜注意事項

   蛋白轉(zhuǎn)移的目的是將蛋白從凝膠上轉(zhuǎn)移到薄膜上，以便進一步進行抗體孵育等后續(xù)操作。 轉(zhuǎn)移電泳槽是蛋白免疫印跡中常用的實驗室儀器。然而，轉(zhuǎn)膜這個過程并不簡單，需要注意許多細節(jié)和技巧。
選擇合適的轉(zhuǎn)膜對于蛋白轉(zhuǎn)移非常重要。常用的轉(zhuǎn)膜膜有NC膜和PVDF膜。NC膜韌性較差，而PVDF膜韌性更好，同時蛋白結(jié)合能力也更強。然而，使用PVDF膜需要進行甲醇或乙醇活化，并且可能存在一定的熒光背景影響。根據(jù)需要進行熒光WB分析時需要注意選擇合適的轉(zhuǎn)膜膜。此外，對于分子量小于20kD的蛋白，建議選擇0.22μm甚至是0.1μm孔徑的膜，以防止轉(zhuǎn)移過程中蛋白的丟失。

轉(zhuǎn)膜有兩種主要的方式，一種是濕轉(zhuǎn)，另一種是半干轉(zhuǎn)。濕轉(zhuǎn)是一種傳統(tǒng)的方式，緩沖條件充足，適用于轉(zhuǎn)移各種分子量的蛋白，但時間較長。半干轉(zhuǎn)則更快，但不同的蛋白可能需要不同的轉(zhuǎn)膜條件，需要根據(jù)實際情況進行調(diào)整。
在轉(zhuǎn)膜過程中，操作細節(jié)也需要特別注意。
1.在切膠時要注意使用切膠板垂直向下切膠，保證膠邊整齊，避免裂開。在做“三明治”結(jié)構(gòu)時，也可以借助切膠板來調(diào)整膠的位置，而不是直接用手操作。
2.在切膠時，需要將目的蛋白和內(nèi)參切入膠中，但要注意保證安全距離，避免誤切目的蛋白。由于各種因素的影響，蛋白的分子量位置可能發(fā)生變化，因此建議切膠時留出一定的安全距離。
3.轉(zhuǎn)膜結(jié)構(gòu)的制作也需要注意細節(jié)。在使用轉(zhuǎn)膜器材前，需要將海綿、濾紙、膜和轉(zhuǎn)膜夾等清洗干凈，避免結(jié)晶鹽離子對轉(zhuǎn)膜均勻度的干擾。在制作“三明治”結(jié)構(gòu)時，趕走每一層的氣泡非常重要�？梢允褂脤ｉT的滾輪、離心管或尺子等工具仔細排除氣泡，但即使如此，轉(zhuǎn)完膜后可能仍會有氣泡出現(xiàn)。這些氣泡可能是無法肉眼可見的小氣泡，在轉(zhuǎn)膜過程中由于發(fā)熱而膨脹，從而導(dǎo)致氣泡的出現(xiàn)。
4.保證膠和膜的均勻緊密貼合也是非常重要的。有時候，在轉(zhuǎn)膜后發(fā)現(xiàn)膠上的蛋白條帶變得模糊不清，與轉(zhuǎn)膜前明顯不同。這可能是由于轉(zhuǎn)膜結(jié)構(gòu)松散，膠與膜貼合不緊密或不均勻?qū)е碌�。因此，及時更換轉(zhuǎn)膜濾紙和海綿，盡量保持膠和膜的均勻緊貼。此外，轉(zhuǎn)膜過程中產(chǎn)生的發(fā)熱也可能導(dǎo)致蛋白分子的不規(guī)則擴散運動，進一步影響貼膜的均勻性。
5.在設(shè)置轉(zhuǎn)膜條件時，要注意保持冰浴。由于轉(zhuǎn)膜過程會產(chǎn)生大量的熱量，實驗室中常常需要將轉(zhuǎn)移電泳槽放入冰中，以預(yù)先降低溫度。此外，對于常規(guī)的濕轉(zhuǎn)，一般使用200mA-300mA的電流，轉(zhuǎn)膜時間需要根據(jù)具體的蛋白分子量、膠的濃度和厚度進行調(diào)整。一般情況下，采用1.0mm厚、10%膠，300mA的電流轉(zhuǎn)膜1-1.5小時，即可基本完成250kD標記物的轉(zhuǎn)移。
6.為了檢驗轉(zhuǎn)膜效率，我們可以參考預(yù)染蛋白標記物。在轉(zhuǎn)膜后，可以使用麗春紅染色PVDF膜，但需要注意PVDF膜的靈敏度較低，因此即使沒有染出蛋白，也不代表蛋白沒有轉(zhuǎn)移到膜上，可以繼續(xù)進行下一步的內(nèi)參檢測。同時，也可以使用考馬斯亮藍染色來觀察膠上蛋白殘留情況。

   在整個蛋白免疫印跡實驗中蛋白轉(zhuǎn)移電泳槽和轉(zhuǎn)膜技巧也很重要哦。只有熟練掌握這些技巧和經(jīng)驗，能夠更好地進行蛋白轉(zhuǎn)移實驗，并取得更準確、可靠的結(jié)果。通過注意細節(jié)，選擇合適的轉(zhuǎn)膜膜和轉(zhuǎn)膜條件，我們可以更好地完成蛋白轉(zhuǎn)移實驗，并為科研工作提供有力支持。