Moxi GO II快速流式細胞儀在單細胞測序中的應用

單細胞測序技術(shù)首次問世于2009年，十幾年來不斷完善和發(fā)展，尤其在近幾年出現(xiàn)爆發(fā)式突破和應用普及。不同于傳統(tǒng)的多細胞層面，單細胞測序技術(shù)聚焦于單個細胞，是對單個細胞在基因組、轉(zhuǎn)錄組、表觀基因組及蛋白組等水平進行測序分析的技術(shù)，反映了細胞間的異質(zhì)性。此外，單細胞平臺一次性可以分離、分析幾千個單細胞，有助于分類或定義新的細胞類型。單細胞測序技術(shù)的發(fā)展和更新，為研究解析單個細胞的行為、機制、與機體的關系等提供了方向，為早期檢測、診斷疾病及疾病個體化治療提供指導。

與傳統(tǒng)測序相比，單細胞測序技術(shù)更為困難和復雜，存在樣本量小、RNA降解快、噪聲和批次效應等問題，需要特殊的實驗設計、數(shù)據(jù)處理和分析方法，每次實驗都會耗費大量的時間、費用以及無形的機會成本。因此單細胞測序平臺都非常強調(diào)樣品制備的重要性，包括精確測量細胞濃度、活率以及確定樣本組成等，這些參數(shù)決定了下游實驗的成敗。

Moxi GO II快速流式細胞儀
美國Orflo Technologies公司將行業(yè)公認的細胞計數(shù)金標準——庫爾特原理（Coulter Principle），與熒光流式檢測技術(shù)相結(jié)合，推出的新一代快速流式細胞儀——Moxi GO II，提供超準確的細胞計數(shù)、細胞活率檢測，以及超高分辨率的細胞粒徑測量，可用于評估樣本純度、準確的細胞核計數(shù)和細胞表型分析，非常適用于單細胞測序中細胞樣本制備的質(zhì)控。
何為庫爾特原理？
細胞/顆粒和緩沖液導電性不同，在恒定電流設計的電路中，懸浮在緩沖液中的顆粒/細胞隨緩沖液通過小孔管時，取代相同體積的緩沖液，從而導致小孔管內(nèi)外兩電極間電阻發(fā)生瞬時變化，產(chǎn)生電位脈沖。脈沖信號的大小和次數(shù)與顆粒的大小和數(shù)目成正比。
庫爾特原理對顆粒個體進行逐個三維測量，不但能準確測量顆粒的粒徑分布，更能進行粒子絕對數(shù)目和濃度的測量。由于檢測時不受激光衍射、散射因樣本顏色或濃度變化的影響，庫爾特原理所測粒徑大小更接近真實。

Moxi Go II的性能

• 卓越的細胞計數(shù)和活率檢測能力

采用庫爾特原理的Moxi GO II系統(tǒng)可對樣本中的細胞進行逐個計數(shù)和體積測量，幾秒鐘內(nèi)計數(shù)多達40000個細胞，數(shù)據(jù)統(tǒng)計的準確性和可靠性遠高于成像類細胞計數(shù)儀（每次只檢測幾百個細胞）。此外，Moxi GO II還配備了488nm激光激發(fā)光源及兩個PMT熒光檢測通道，能夠進行基于碘化丙啶（PI）熒光染料的細胞活率檢測，其檢測靈敏度、準確度與流式細胞儀相當，遠高于成像類細胞計數(shù)儀（如圖3所示）。Moxi GO II細胞計數(shù)和活率測量結(jié)果的準確性和一致性，為單細胞測序中細胞樣本的質(zhì)控提供了可靠依據(jù)。

• 無與倫比的粒徑分辨率

成像類細胞計數(shù)儀基于2D圖像分析，通過軟件算法識別細胞邊界以確定細胞直徑，這種方法依賴成像效果，不確定因素多，易出現(xiàn)“誤判”，如將碎片識別為細胞等。Moxi GO II根據(jù)庫爾特原理，采用的是3D立體測量，獲得更為真實的細胞大小信息，提供高分辨率的細胞粒徑分布圖。如圖4所示，將5種不同大小的微珠（4.1μm，6μm，7.9μm，10.1μm，和 16μm）混樣，分別用Moxi GO II和成像類細胞計數(shù)儀檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Moxi GO II能夠很好的區(qū)分5個峰，而成像類設備只能區(qū)分兩個峰，前面的4個峰無法區(qū)分開來（圖4紅框內(nèi)）。
高分辨率的直方圖結(jié)果，也可用于評估細胞樣本的聚集程度，研究者可據(jù)此評估是否需要在后續(xù)操作之前對樣本進行調(diào)整。單細胞測序技術(shù)要求樣本為單細胞懸液，以確保每個油滴中僅捕獲一個細胞。細胞聚集狀態(tài)會對下游實驗造成重要影響。如圖6所示，在Moxi GO II系統(tǒng)中，將聚集的HEK-293細胞結(jié)果直方圖（灰色曲線）與單分散的單細胞樣本結(jié)果直方圖（綠色曲線）疊加比較，發(fā)現(xiàn)灰色曲線不僅峰值分布的偏斜（長尾）的顯著增加，而且還顯示了模態(tài)峰值的增加，因為樣本主要由多峰（細胞簇）組成。

• 樣品純度評估指標

在單細胞測序技術(shù)樣本制備過程中，關鍵部分是將單個細胞包裹進油包水的微液滴中。
因此，當研究人員研究特定類型細胞時，盡可能最大限度提高含有該類型細胞的液滴比例。Moxi GO II可通過粒徑和熒光測量來評估樣品純度，如圖7所示。圖中紅色直方圖是粒徑分布圖疊加。研究者可通過粒徑門控計算RBC“污染”程度（黃色箭頭所指為RBC峰），還可通過熒光標記，進行第二維度的純度檢測（黃色框內(nèi)是通過PE-CD45（HI30）抗體標記的白細胞）。

單細胞測序技術(shù)常用磁珠來純化細胞。圖8展示了初始PBMC樣本（灰色曲線）與磁珠分離后的單核細胞（綠色曲線）粒徑直方圖比較，分離后，去掉了較小的淋巴細胞峰。Moxi GO II高分辨率粒徑測量為研究者帶了便利，可通過無標記的粒徑分布來驗證樣品純度。

• 精確的細胞核計數(shù)

單細胞測序技術(shù)中，當樣本為細胞核，需要對其進行精確計數(shù)和測量。由于細胞核體積較�。ㄖ睆酵ǔ�為4-9μm），成像類細胞計數(shù)儀難以提供可靠的結(jié)果。而Moxi GO II可分辨低至3μm的顆粒，對細胞核進行快速可靠的計數(shù)。同時，還可通過PI染色，增加細胞核分辨率。如圖9所示，圖9a為完整PBMC細胞檢測結(jié)果（活率vs粒徑散點圖），圖9b為裂解后細胞核檢測結(jié)果，計數(shù)結(jié)果相同（1.23e5/ml）。分離的細胞核樣本粒徑減少，熒光信號增強，符合預期。

• 細胞表型分析

單細胞測序中，使用細胞表面免疫標記進行表型分析，即用于基因組分析之前簡單地確認或鑒定細胞組成（例如，PBMC樣品中CD8陽性T細胞的百分比），也可以用于樣品純度檢測（例如，在T細胞分選或磁珠分離后使用CD3來確定T細胞純度）。Moxi GO II具有488nm激光器和兩個PMT，可同時檢測兩個熒光團（例如FITC和PE），進行精確的計數(shù)和粒徑測量。如圖10所示，具有FITC抗人CD8（HIT8a，BioLegend）和PE抗人CD3（OKT3，BioLegend）的雙重標記。使用Moxi GO II象限門控可輕松圈定陽性與陰性群體的熒光，使研究人員能夠區(qū)分細胞群體。對于分選后的純度檢測，第一PMT/通道（525/45nm）可用于純化細胞的獨特抗體標記。第二通道646nm/LP可用于測量PI染色（活率）。通過這種設置，研究者一次測試，可獲得了多個質(zhì)控信息：表型純度、尺寸分布（例如聚類）、濃度和活力。
總結(jié)：
單細胞測序技術(shù)獨特復雜，成本昂貴，因此樣本處理制備就顯得尤為重要，是下游實驗成敗的基礎。Orflo的Moxi GO II系統(tǒng)非常適用于細胞樣本的全程監(jiān)測。 Moxi GO II采用庫爾特原理進行細胞計數(shù)和粒徑測量，同時采用488nm激光光源，結(jié)合兩個PMT通道，525/45nm通道和561nm/LP（或者646nm/LP，可根據(jù)需要更換），進行細胞活率、細胞凋亡、轉(zhuǎn)染效率、活性氧簇、線粒體膜電位等常規(guī)流式檢測。
 

PMT 通道	兼容染料（包括但不限于）
525/45nm通道	Annexin V-FITC， Alexa Fluor? 488， BB515，GFP， Calcein等
561nm/LP通道	PE，PI，RFP等
646nm/LP通道	PI，7-AAD等

儀器設計小巧輕便，無需預熱，開機即用，預設程序，觸屏操控，運行后10秒即可給出測試結(jié)果，使用后也無需清潔維護。Moxi GO II功能多樣，簡單易用，為廣大研究者提供了一個非常實用的檢測工具。通過Moxi GO II，無論是經(jīng)驗豐富的流式專家，還是初試身手的實驗小白，都可以輕松完成實驗。

美國Orflo Technologies公司是一家非常專業(yè)的細胞分析儀器研發(fā)和制造企業(yè)，擁有多項專利技術(shù)，產(chǎn)品以庫爾特原理的高精細胞計數(shù)儀和超快流式細胞儀為主。作為中國地區(qū)獨家代理，環(huán)亞生物科技有限公司全權(quán)負責Orflo Technologies產(chǎn)品在中國地區(qū)的推廣、銷售，為廣大用戶提供專業(yè)的技術(shù)咨詢和產(chǎn)品服務。

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