DAP-seq技術(shù)在棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生（SE）研究中的應(yīng)用

體細(xì)胞胚胎發(fā)生（Somatic embryogenesis, SE）可以不經(jīng)過(guò)配子融合，由體細(xì)胞分化發(fā)育成整個(gè)植株。SE是一個(gè)多因素的發(fā)育過(guò)程，也是研究細(xì)胞全能性的理想模型。目前，SE在多個(gè)領(lǐng)域得到了應(yīng)用，例如：種質(zhì)保護(hù)、人工種子生產(chǎn)、單倍體育種、無(wú)性繁殖，以及作為植物生物技術(shù)研究領(lǐng)域的平臺(tái)工具。然而，目前對(duì)SE調(diào)控機(jī)制的理解僅限于少數(shù)模式植物（例如：擬南芥），而且不同物種之間SE調(diào)控機(jī)制存在很大差異。因此，深入研究重要經(jīng)濟(jì)作物棉花的SE調(diào)控機(jī)制對(duì)棉花育種和繁殖具有重要的意義。

2023年7月11日，鄭州大學(xué)與中棉所棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的研究成果發(fā)表在New Phytologist（IF=9.4，Q1區(qū)）期刊上，題目為“GhRCD1 regulates cotton somatic embryogenesis by modulating the GhMYC3-GhMYB44-GhLBD18 transcriptional cascade”。該研究使用DNA親和純化測(cè)序(DAP-seq)技術(shù)鑒定了陸地棉GhMYC3的結(jié)合基序和靶基因。揭示了GhRCD1-GhMYC3-GhMYB44-GhLBD18轉(zhuǎn)錄級(jí)聯(lián)調(diào)控棉花SE的分子機(jī)制，為細(xì)胞全能性以及棉花基因工程研究提供了新思路。

1. GhMYC3是棉花SE過(guò)程中一個(gè)重要的調(diào)控因子

通過(guò)序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析，在陸地棉中篩選到一個(gè)與Homo-MYC具有高度系統(tǒng)發(fā)育相似性的同源基因GhMYC3，具有1個(gè)bHLH和1個(gè)bHLH-MYC_N結(jié)構(gòu)域。于是假設(shè)GhMYC3在決定細(xì)胞命運(yùn)方面具有與人類(lèi)MYC相似的生理功能。

為研究GhMYC3對(duì)SE過(guò)程中細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)變的影響，構(gòu)建了過(guò)表達(dá)GhMYC3的棉花轉(zhuǎn)基因系（OE-GhMYC3）。表型分析發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)GhMYC3顯著誘導(dǎo)了SE，促進(jìn)愈傷組織生長(zhǎng)。隨后，GhMYC3的RNAi細(xì)胞系（Ri-MYC3）表型分析發(fā)現(xiàn)Ri-GhMYC3與WT的愈傷組織形成率一致，但新鮮愈傷組織的重量（FW）略輕，胚性愈傷組織（EC）分化率顯著降低。以上結(jié)果表明，GhMYC3促進(jìn)棉花體細(xì)胞向愈傷組織的去分化，但阻止了向EC的轉(zhuǎn)變過(guò)程。

GhMYC3調(diào)控棉花SE過(guò)程

(a) 智人、陸地棉、擬南芥中MYC蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析。(b) 棉花SE過(guò)程示意圖。下胚軸作為外植體，用愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)，體細(xì)胞去分化形成愈傷組織，在60-90天的生長(zhǎng)過(guò)程中，增殖的愈傷組織重新分化為EC，EC發(fā)育成體細(xì)胞胚，而后在體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上萌發(fā)為幼苗。(c) WT、OE-GhMYC3、Ri-GhMYC3在EC分化過(guò)程中的形態(tài)差異。(d) 長(zhǎng)日照下生長(zhǎng)的WT、OE-GhMYC3、Ri-GhMYC3植株葉片組織中GhMYC3的相對(duì)表達(dá)量。(e) WT、OE-GhMYC3、Ri-GhMYC3愈傷組織的FW。(f) WT、OE-GhMYC3、Ri-GhMYC3的EC分化率。

2. GhMYC3直接與GhMYB44和GhLBD18的啟動(dòng)子結(jié)合，調(diào)控其表達(dá)

DAP-seq分析鑒定了GhMYC3的DNA結(jié)合基序及其下游靶基因。鑒于愈傷組織形成和根系生長(zhǎng)具有共同的調(diào)控途徑，作者鑒定到了與根系發(fā)育和生長(zhǎng)素信號(hào)通路有關(guān)的2個(gè)靶基因GhMYB44和GhLBD18。亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)GhMYC3、GhMYB44和GhLBD18主要表達(dá)于細(xì)胞核。在GhMYB44和GhLBD18的啟動(dòng)子中存在與GhMYC3結(jié)合的G-box（CACGTT）元件。酵母單雜交（Y1H）和電泳遷移率（EMSA）實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了GhMYC3特異性地結(jié)合GhMYB44和GhLBD18啟動(dòng)子中的G-box基序。另外，煙草葉片瞬時(shí)表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)GhMYC3以G-box依賴(lài)的方式激活GhLBD18的轉(zhuǎn)錄，抑制GhMYB44的轉(zhuǎn)錄。

GhMYC3直接結(jié)合并調(diào)控GhMYB44和GhLBD18的轉(zhuǎn)錄

(a) GhMYC3的結(jié)合序列在基因組上的分布。(b) GhMYC3的主要結(jié)合基序CA T/C GT T/G。(c) GhMYC3下游基因的GO富集分析。(d) GhMYB44和GhLBD18啟動(dòng)子序列中包含G-box基序。(e) Y1H實(shí)驗(yàn)。(f) EMSA實(shí)驗(yàn)。(g-h) 煙草葉片瞬時(shí)表達(dá)分析及LUC熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)。

3. GhMYB44與GhLBD18的啟動(dòng)子直接相互作用，抑制其表達(dá)

DAP-seq分析發(fā)現(xiàn)在GhLBD18啟動(dòng)子中存在MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。Y1H和EMSA實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了GhMYB44與GhLBD18啟動(dòng)子的直接結(jié)合。瞬時(shí)基因表達(dá)分析表明GhMYB44通過(guò)直接結(jié)合GhLBD18的啟動(dòng)子序列抑制其表達(dá)。以上結(jié)果表明，GhMYC3除了通過(guò)與GhLBD18啟動(dòng)子特定位點(diǎn)結(jié)合直接激活GhLBD18的表達(dá)外，還通過(guò)GhMYB44-GhLBD18轉(zhuǎn)錄級(jí)聯(lián)信號(hào)間接調(diào)控GhLBD18的表達(dá)。

4. GhMYB44通過(guò)GhLBD18調(diào)控SE過(guò)程

利用OE-GhMYB44、SRDX-GhMYB44（特異性沉默系）和OEGhLBD18棉花株系進(jìn)一步研究MYB44調(diào)控SE的過(guò)程。與WT相比，在OE-GhMYB44中愈傷組織起始延緩，愈傷組織增殖減弱，EC分化加速；相反，在SRDX-GhMYB44和OE-GhLBD18中愈傷組織起始提前，愈傷組織增殖增強(qiáng)，EC分化延遲。因此，GhMYB44在GhLBD18的上游發(fā)揮作用，在愈傷組織起始、愈傷細(xì)胞增殖和愈傷組織向EC的轉(zhuǎn)變過(guò)程中控制細(xì)胞命運(yùn)的決定。

5. GhRCD1與GhMYC3相互作用調(diào)節(jié)SE過(guò)程

采用酵母雙雜交（Y2H）鑒定到在SE過(guò)程中與GhMYC3互作的蛋白GhRCD1，該蛋白在愈傷組織和EC形成的不同階段均被誘導(dǎo)，但在體細(xì)胞胚中保持較低水平。雙分子熒光互補(bǔ)（BiFC）實(shí)驗(yàn)、Pull down實(shí)驗(yàn)、LUC互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)證明了GhMYC3與GhRCD1蛋白有相互作用。GhRCD1的敲除突變體（KO-GhRCD1）和過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因系（OE-GhRCD1）實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，與WT相比KO-GhRCD1表現(xiàn)出愈傷組織起始提早，生長(zhǎng)加快，F(xiàn)W增加；而與WT和KO-GhRCD1相比，OE-GhRCD1表現(xiàn)為愈傷組織起始延遲，增殖減少，EC分化率降低。結(jié)果表明，RCD1的適當(dāng)表達(dá)對(duì)SE過(guò)程至關(guān)重要，但RCD1的過(guò)表達(dá)或突變均不利于愈傷組織細(xì)胞的命運(yùn)轉(zhuǎn)變過(guò)程。

GhRCD1與GhMYC3有相互作用

(a) Y2H實(shí)驗(yàn)。(b) BiFC實(shí)驗(yàn)。(c) Pull down實(shí)驗(yàn)。(d) LUC互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)。(e-g) KO-GhRCD1和OE-GhRCD1在SE不同發(fā)育階段的形態(tài)學(xué)分析(e)、FW分析(f)和EC分化率分析(g)。

6. GhRCD1拮抗GhMYC3調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄能力

使用雙熒光素酶報(bào)告（Dual-luc）實(shí)驗(yàn)檢測(cè)GhRCD1是否影響GhMYC3對(duì)其下游靶點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。將LUC報(bào)告基因分別與GhMYB44和GhLBD18啟動(dòng)子融合，再通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染測(cè)定啟動(dòng)子活性。GhMYC3的過(guò)表達(dá)抑制了GhMYB44啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的LUC表達(dá)，但過(guò)表達(dá)GhRCD1削弱了這種抑制作用；GhMYC3增強(qiáng)了GhLBD18啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的LUC表達(dá)，而過(guò)表達(dá)GhRCD1削弱了這種增強(qiáng)作用。此外，GhMYB44能夠直接抑制GhLBD18的表達(dá)，但GhMYB44和GhMYC3共表達(dá)導(dǎo)致GhLBD18啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的LUC表達(dá)水平顯著高于單獨(dú)表達(dá)GhMYB44，這表明GhMYC3直接干擾了GhMYB44對(duì)GhLBD18的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明GhMYB44的表達(dá)水平與GhMYC3的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。GhLBD18在OE-GhMYC3和SRDX-GhMYB44中表達(dá)上調(diào)，而在Ri-GhMYC3細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)�？傊�，在SE過(guò)程中GhRCD1抑制GhMYC3對(duì)GhMYB44和GhLBD18的表達(dá)調(diào)控能力。

7. 由RCD1-MYC3-MYB44-LBD18級(jí)聯(lián)介導(dǎo)的活性氧穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)變

利用ROS熒光探針H₂DCF和BCIP-NBT檢測(cè)SE不同發(fā)育階段的ROS積累，發(fā)現(xiàn)ROS最初在外植體階段的損傷組織中增加，細(xì)胞內(nèi)ROS水平與愈傷組織細(xì)胞增殖呈正相關(guān)，第21 d時(shí)在發(fā)育的愈傷組織中觀察到氧化爆發(fā)。在EC發(fā)育過(guò)程中，ROS在愈傷組織的胚性前區(qū)富集，但在其他部位枯竭。過(guò)表達(dá)GhMYC3和GhLBD18導(dǎo)致ROS積累，促進(jìn)愈傷組織細(xì)胞增殖，然而過(guò)表達(dá)GhMYB44則相反。最后，該研究提出了一個(gè)愈傷組織形成和SE的模型。在下胚軸外植體培養(yǎng)的不同發(fā)育階段，GhRCD1、GhMYC3、GhMYB44和GhLBD18的表達(dá)水平與細(xì)胞命運(yùn)決定和細(xì)胞分化動(dòng)態(tài)緊密相關(guān)。這些基因的精確時(shí)空表達(dá)可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)ROS的積累，進(jìn)而影響SE過(guò)程中的細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)變。

GhRCD1-GhMYC3-GhMYB44-GhLBD18信號(hào)級(jí)聯(lián)調(diào)控SE的機(jī)制模型圖

在愈傷組織誘導(dǎo)過(guò)程中，GhMYC3通過(guò)調(diào)控GhMYB44和GhLBD18的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)一步激活ROS依賴(lài)的信號(hào)通路，使ROS優(yōu)先在誘導(dǎo)部位積累，并在愈傷組織增殖過(guò)程中達(dá)到峰值。在EC獲得過(guò)程中，較高水平的GhRCD1可能抑制GhMYC3對(duì)GhMYB44和GhLBD18的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，從而相應(yīng)地減少ROS的積累，而且ROS在EC周?chē)�呈極性分布。

本文小結(jié)：該研究揭示了SE過(guò)程中細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)變的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。GhMYC3通過(guò)結(jié)合GhMYB44和GhLBD18啟動(dòng)子中的G-box元件調(diào)節(jié)其表達(dá)。GhRCD1拮抗GhMYC3對(duì)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控能力。GhRCD1-GhMYC3-GhMYB44-GhLBD18組成的轉(zhuǎn)錄級(jí)聯(lián)模塊呈現(xiàn)時(shí)序表達(dá)模式，并時(shí)序性的調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)ROS穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而影響SE過(guò)程中細(xì)胞的命運(yùn)。

參考文獻(xiàn)：Yuan J, Liu X, Zhao H, Wang Y, Wei X, Wang P, Zhan J, Liu L, Li F, Ge X. GhRCD1 regulates cotton somatic embryogenesis by modulating the GhMYC3-GhMYB44-GhLBD18 transcriptional cascade. New Phytol. 2023. doi: 10.1111/nph.19120. (IF=10.323)

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