文獻分享：宏基因組二代測序mNGS助力診斷兒童神經(jīng)系統(tǒng)、尿路感染

背景介紹：

mNGS即宏基因組二代測序，這種檢測方法不需要額外培養(yǎng)微生物，直接從環(huán)境/臨床樣品中提取得到全部微生物的DNA，利用二代測序的方法研究樣本中全部微生物的遺傳組成及其群落功能，相比培養(yǎng)微生物，克快速獲得分析報告。
 

近年來mNGS關(guān)注度極高，醫(yī)院和第三方醫(yī)學檢驗公司也開始開展相關(guān)項目，但針對類疑難樣本的處理沒有標準的方案，今天介紹兩篇文獻詳細介紹了整體實驗方案，包括所需樣本體積、樣本采集運輸保存、上清分離、核酸提取、建庫等，其中樣本核酸提取和建庫分別采用了QIAamp DNA Micro Kit和QIAseq Ultralow Input Library Kit兩款來自QIAGEN的明星產(chǎn)品。

mNGS用于診斷兒童神經(jīng)系統(tǒng)感染

為了評估兒童腦脊液中游離DNA（cfDNA）mNGS的性能，本文章分析了cfDNA mNGS在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染或非感染性神經(jīng)疾病兒童中的效率。采用124名隨機受試者的腦脊液樣本，評價cfDNA的mNGS與全細胞DNA（wcDNA）之間的準確性。
 

樣本類型：腦脊液
 

流程：每個受試者采集約1-2 mL的腦脊液，在提取cfDNA時，將腦脊液樣品中的細胞通過1600g離心10 min去除，然后在4°C下以16000g離心10 min。從上清液中提取并純化cfDNA。在提取wcDNA時，使用研磨儀對腦脊液樣本均質(zhì)化，然后，將處理后的標本在10000g下離心5 min，二者均使用QIAamp DNA micro Kit（56304）進行純化。
 

使用Qubit 檢測核酸的質(zhì)量，宏基因組學文庫由QIAseq Ultralow Input Library Kit（180497），僅需最低10pg的起始DNA。文庫質(zhì)量由安捷倫2100生物分析儀進行監(jiān)測，在Illumina Nextseq 550平臺上進行匯集和測序。
 

結(jié)果：cfDNA mNGS檢測到的微生物廣泛檢出率為71.0%，與臨床診斷的敏感性和總符合率分別為68.9%和67.5%。與wcDNA mNGS相比，cfDNA mNGS在檢測病毒（66對13）和分枝桿菌（7對1）方面具有更高的效果，且reads顯著高于每百萬分。mNGS試驗的最佳時間為抗感染治療開始后1~6天，mNGS開始較早，細菌中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的識別越好。
 

結(jié)論：cfDNA mNGS在兒童中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的致病病原體檢測方面總體上優(yōu)于傳統(tǒng)方法，甚至優(yōu)于wcDNA mNGS。

mNGS用于診斷尿路感染

尿路感染（UTI）是最常見的感染之一，病原體培養(yǎng)是診斷UTI的金標準，然而培養(yǎng)耗時且檢出率較低。本文章的研究者們在臨床中發(fā)現(xiàn)，有些患者在尿液病原體培養(yǎng)結(jié)果為陰性，但他們有多次異常的尿檢結(jié)果和持續(xù)的尿路癥狀，并仍被懷疑患有UTI。故而將mNGS檢測技術(shù)應(yīng)用于UTI，并與常規(guī)實驗室檢測進行比較，并評估患者的臨床結(jié)果。
 

樣本類型：尿液
 

流程：3ml尿液用于mNGS檢查，使用干冰保存，24h內(nèi)運送至實驗室，離心去除樣品中的細胞，收集上清后提取DNA。使用QIAamp DNA micro Kit（56304）進行純化核酸。使用Qubit 檢測核酸的質(zhì)量，宏基因組學文庫由QIAseq Ultralow Input Library Kit（180497），僅需最低10pg的起始DNA。文庫質(zhì)量由安捷倫2100生物分析儀進行監(jiān)測，在Illumina Nextseq 550平臺上進行匯集和測序。
 

結(jié)果：在尿液樣本的細菌和真菌檢測中，在29例mNGS（87.9%）中至少檢測到一種病原體，其中19例（57.6%）mNGS陽性但尿液微生物培養(yǎng)陰性，10例（30.3%）mNGS和培養(yǎng)陽性。其余4例（12.1%）患者經(jīng)兩種檢測均為陰性�？傮w而言，mNGS的表現(xiàn)優(yōu)于培養(yǎng)物。此外，mNGS檢測到了更廣泛的病原體譜，檢測到了26種，而在培養(yǎng)中只發(fā)現(xiàn)了5種。mNGS敏感性顯著高于培養(yǎng)檢測。
 

結(jié)論：mNGS是一種比培養(yǎng)有明顯優(yōu)勢的技術(shù)，特別是在難以診斷和治療的混合感染和尿路感染的背景下。它有助于提高對病原體的檢測，指導治療策略的改變，是對尿液培養(yǎng)的有效補充。

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doi: 10.3389/fcimb.2023.1119020

doi: 10.1128/spectrum.02530-22