NEPA21技術(shù)：異質(zhì)核核糖核蛋白U (HNRNPU)保護(hù)了發(fā)育中的小鼠皮層

Tamar Sapir1, Aditya Kshirsagar 1, Anna Gorelik1, Tsviya Olender1, Ziv Porat 2, Ingrid E. Scheffer 3,David B. Goldstein4, Orrin Devinsky 5 & Orly Reiner
 

細(xì)胞死亡包括細(xì)胞程序性死亡（主動(dòng)死亡）、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死（被動(dòng)死亡），可由多種機(jī)制引起，其中Tp53通路起著關(guān)鍵作用。細(xì)胞死亡介導(dǎo)途徑的調(diào)控發(fā)生在多個(gè)階段，包括轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后和翻譯后的水平。RNA剪接是一種轉(zhuǎn)錄后事件，根據(jù)特定的細(xì)胞環(huán)境允許包含或排除基因序列。剪接體介導(dǎo)RNA剪接，這是一種包含RNA(如小核核糖核蛋白和異質(zhì)核核糖核蛋白(HNRNPs))和其他蛋白質(zhì)的復(fù)合體。而一種介導(dǎo)核染色質(zhì)形成的剪接體異質(zhì)核核糖核蛋白HNRNPU編碼異質(zhì)核核糖核蛋白U在哺乳動(dòng)物的發(fā)育過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。

HNRNPU的微缺失或點(diǎn)突變都會(huì)導(dǎo)致一系列疾病，包括早發(fā)性癲癇和嚴(yán)重的智力障礙、低外顯性小頭畸形、胼胝體薄、面部畸形和張力減退。然而，對(duì)于發(fā)育中的大腦中HNRNPU的功能還缺乏了解。近日，以色列-雷霍沃特魏茲曼科學(xué)研究所、墨爾本大學(xué)聯(lián)合紐約-哥倫比亞大學(xué)基因組醫(yī)學(xué)研究所，三家研究團(tuán)隊(duì)在國(guó)際知名科學(xué)期刊Nature Communications上發(fā)表了題為“Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein U (HNRNPU) safeguards the developing mouse cortex”的文章，目的是了解HNRNPU在大腦發(fā)育中的作用。結(jié)果顯示HNRNPU功能的喪失導(dǎo)致有絲分裂后神經(jīng)元和神經(jīng)祖細(xì)胞的快速死亡，后者的敏感性明顯更高。此外，參與細(xì)胞存活、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和突觸形成的多個(gè)基因的表達(dá)和選擇性剪接在Hnrnpu條件突變后受到影響，降低剪接因子SRSF3的水平可以抑制HNRNPU功能效應(yīng)的喪失，并改善神經(jīng)祖細(xì)胞的生存能力和神經(jīng)元遷移。最后研究人員并確定了可以部分逆轉(zhuǎn)Hnrnpu突變胚胎大腦皮層結(jié)構(gòu)的丟失、改善徑向神經(jīng)遷移缺陷和挽救培養(yǎng)的神經(jīng)祖細(xì)胞死亡的遺傳藥物試劑。
 

為了研究HNRNPU在大腦發(fā)育中的作用，使用含條件HNRNPU等位基因的小鼠與Emx1^Cre小鼠雜交。結(jié)果顯示發(fā)育中小鼠的大腦表達(dá)豐富HNRNPU水平，最顯著的是在腦室區(qū)(VZ)的頂端和皮質(zhì)板(圖1A-C’)，使用ImageStream流式細(xì)胞儀分析游離神經(jīng)球中的HNRNPU(圖1D、E)表明蛋白質(zhì)的表達(dá)是動(dòng)態(tài)的，雖然有絲分裂細(xì)胞表達(dá)高水平的HNRNPU，但蛋白質(zhì)不附著在染色質(zhì)上。相反，G1/S期細(xì)胞的HNRNPU信號(hào)強(qiáng)度降低，更好的與染色質(zhì)共定位。Emx1^Cre表達(dá)和Hnrnpu突變的大腦區(qū)域逐漸被忽略，而E18皮質(zhì)更小，P8大腦缺乏端腦(圖1F-I)。在E18，皮質(zhì)的內(nèi)側(cè)區(qū)域消失了，但皮質(zhì)的殘余在外側(cè)仍然可見(jiàn)(G, M)。這些區(qū)域表達(dá)Tbr1，但其在更深的皮層典型定位丟失了(圖1K, N)。在突變體皮質(zhì)中可以檢測(cè)到膠質(zhì)纖維酸性蛋白然而，膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）在皮質(zhì)板上的表達(dá)減少了約40%(圖1L, O, P)。經(jīng)過(guò)21天，突變小鼠存活了下來(lái)，但體積變小了且所有皮質(zhì)結(jié)構(gòu)都基本喪失。(圖1T, V)，然而，該區(qū)域表達(dá)神經(jīng)元和膠質(zhì)標(biāo)志物的混合物(圖1Q-V)。
 

圖1:HNRNPU在小鼠有絲分裂神經(jīng)祖細(xì)胞中強(qiáng)烈表達(dá)，對(duì)大腦發(fā)育至關(guān)重要

作者使用延時(shí)顯微鏡觀察了電轉(zhuǎn)染后體外培養(yǎng)的皮層細(xì)胞的存活情況(圖2A-M)，以更好地了解突變大腦中觀察到的表型(Emx1^cre/+ Hnrnpu ^fl/fl)。培養(yǎng)的細(xì)胞成像3小時(shí)(圖2A-M)，在體外兩天的修復(fù)(圖2N-V)。Hnrnpu ^fl/fl胚胎大腦用雙色Cre報(bào)告蛋白CAG::spotlight (CAG::SL)進(jìn)行電轉(zhuǎn)染，并結(jié)合無(wú)Cre、構(gòu)成Cre (CAG:: NLS-Cre- GFP)、中間祖細(xì)胞Cre (Tbr2:: Cre)或有絲分裂后神經(jīng)元Cre (Ta1::Cre)。CAG聚光組成性表達(dá)了一種綠色熒光蛋白，該蛋白在Cre活性被切除后，允許一種紅色熒光蛋白表達(dá)。在成像期間，對(duì)照細(xì)胞中未觀察到細(xì)胞死亡(圖2A-C, M)。當(dāng)使用Ta1啟動(dòng)子時(shí)，可以看到表達(dá)切除的Cre報(bào)告基因的活細(xì)胞比例更高(圖2V)
 

圖2:神經(jīng)祖細(xì)胞對(duì)HNRNPU丟失高度敏感
 

作者從E13 Hnrnpu^fl/fl Emx1^Cre/₊ (Homo)、Hnrnpu^fl/+ Emx1^Cre/+ (Het)胚胎和對(duì)照胎鼠(WT)的皮層中生成RNA-seq文庫(kù)(圖3)。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，以深入了解所觀察到的Hnrnpu缺失病理的分子機(jī)制，結(jié)果表明，HNRNPU強(qiáng)烈影響基因表達(dá)。
 

圖3：Hnrnpu突變體皮層顯示了對(duì)大腦發(fā)育和功能至關(guān)重要的基因的mRNA表達(dá)和選擇性剪接的變化
 

由于Hnrnpu的突變會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，為了驗(yàn)證這一表型，研究人員將小鼠皮層胚胎神經(jīng)祖細(xì)胞作為原代神經(jīng)球培養(yǎng)，使用NEPA21電轉(zhuǎn)儀將CRISPR/Cas9 Hnrnpu gRNA轉(zhuǎn)染到培養(yǎng)的神經(jīng)球中，據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)估計(jì)，40%的分離細(xì)胞為GFP陽(yáng)性，活細(xì)胞高達(dá)90%，并使用10× Genomics^©平臺(tái)進(jìn)行單細(xì)胞RNA-seq實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示低Hnrnpu表達(dá)的細(xì)胞TP53通路活性增加，而在同一培養(yǎng)物中具有高Hnrnpu表達(dá)的細(xì)胞，該通路被抑制。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一發(fā)現(xiàn)，我們追蹤了接受相同培養(yǎng)條件的神經(jīng)球以及突變腦切片中TP53的動(dòng)態(tài)穩(wěn)定性(圖4A-F)。通過(guò)Ingenuity分析確定的TP53調(diào)控的272個(gè)基因中的幾個(gè)關(guān)鍵基因(圖4G)并追蹤了轉(zhuǎn)染Hnrnpu sgRNA的神經(jīng)球的功能顯示了大多數(shù)已驗(yàn)證的與該通路相關(guān)的基因之間可能的網(wǎng)絡(luò)連接示意圖（圖4H-I’）

（略）
圖4 :Hnrnpu KO.后TP53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑被激活
 

研究人員還研究了減少神經(jīng)圈培養(yǎng)中觀察到的細(xì)胞死亡的遺傳學(xué)方法。除了通過(guò)CRISPR介導(dǎo)的Tp53缺失或通過(guò)含有Mdm2的外顯子3的異位表達(dá)來(lái)操縱P53水平外，作者還檢測(cè)了CRISPR-介導(dǎo)的Srsf3缺失(圖5B-D)。在缺乏HNRNPU的情況下，SRSF3蛋白水平降低，Mdm2外顯子3包合物的比例恢復(fù)到野生型水平，通過(guò)觀察電轉(zhuǎn)染后的神經(jīng)球圖像（圖5A）發(fā)現(xiàn)神經(jīng)球的大小進(jìn)行了恢復(fù)。此外，Hnrnpu的缺失影響了與細(xì)胞遷移和運(yùn)動(dòng)以及細(xì)胞骨架有關(guān)的基因，這些基因都對(duì)正常的神經(jīng)元遷移至關(guān)重要(圖3B)。研究人員并在小鼠子宮內(nèi)電轉(zhuǎn)染法檢測(cè)了Hnrnpu缺失對(duì)神經(jīng)元遷移的影響,小鼠妊娠14天后進(jìn)行麻醉，暴露子宮口，用口吸管通過(guò)子宮，通過(guò)拉動(dòng)的玻璃毛細(xì)血管將與Fast Green（2μg/μl；Sigma）混合的質(zhì)粒微量注射到胚胎的側(cè)腦室。通過(guò)NepaGene公司電轉(zhuǎn)儀器NEPA21產(chǎn)生的5個(gè)脈沖放電程序來(lái)完成電轉(zhuǎn)染，脈沖通過(guò)位于每個(gè)胚胎頭部?jī)蓚?cè)的直徑為10毫米的鍍鉑鑷子電極通過(guò)子宮傳遞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在子宮內(nèi)植入Hnrnpu sgRNA可有效降低Hnrnpu蛋白水平，RNA剪接的調(diào)節(jié)可以逆轉(zhuǎn)由HNRNPU功能喪失導(dǎo)致細(xì)胞活力的受損和神經(jīng)元遷移。

（略）

圖5：Srsf3下調(diào)補(bǔ)償了HNRNPU的活性損失
 

最后，研究人員通過(guò)重點(diǎn)研究TP53通路在體外培養(yǎng)祖細(xì)胞死亡和皮層結(jié)構(gòu)完全丟失中的作用，HNRNPU和SRSF3的減少會(huì)影響多個(gè)基因的表達(dá)和剪接導(dǎo)致了TP53上游調(diào)控因子的改變，從而激活該通路導(dǎo)致細(xì)胞壞死。應(yīng)用不同的細(xì)胞死亡抑制劑(例如Caspase, TP53壞死抑制劑)挽救了神經(jīng)球的生長(zhǎng)，增加祖細(xì)胞增殖，并部分恢復(fù)層標(biāo)記物的表達(dá)使得大腦皮層表現(xiàn)出了更完善的組織結(jié)構(gòu)，并顯著改善了中心體同化�？傊�，數(shù)據(jù)表明HNRNPU調(diào)節(jié)剪接，對(duì)大腦的發(fā)育至關(guān)重要。

在本研究中，作者使用了免疫組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、神經(jīng)球制備及電轉(zhuǎn)染、子宮內(nèi)電轉(zhuǎn)染、成像流式細(xì)胞術(shù)、構(gòu)建MARS-seq文庫(kù)和單細(xì)胞RNA-seq等方法才使得實(shí)驗(yàn)順利完成。

NEPAGENE公司是全球知名的電轉(zhuǎn)染和電融合等設(shè)備研發(fā)及生產(chǎn)廠家，本實(shí)驗(yàn)中，研究人員借助NEPA21卓越的基因?qū)�入功能完成了CRISPR/Cas9 Hnrnpu gRNA導(dǎo)入到小鼠皮質(zhì)層培養(yǎng)的神經(jīng)球以及子宮內(nèi)發(fā)育中的胚胎大腦中，從而驗(yàn)證了Hnrnpu的突變會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡的這一表型，同時(shí)細(xì)胞計(jì)數(shù)表明轉(zhuǎn)染效果好，細(xì)胞的存活率高。

本文采用的是NEPA GENE品牌的NEPA21基因高效轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，采用全新設(shè)計(jì)的電轉(zhuǎn)程序，電壓衰減（Voltage Decay）模式；基因?qū)��?反向?qū)�入模式。不需要特殊轉(zhuǎn)染試劑輔助，節(jié)省實(shí)驗(yàn)成本；電轉(zhuǎn)程序中的各項(xiàng)參數(shù)實(shí)時(shí)可見(jiàn)、可調(diào)，特別適用于優(yōu)化原代細(xì)胞、非常見(jiàn)細(xì)胞的電轉(zhuǎn)參數(shù)。
 

NEPA21專(zhuān)利的電壓衰減（Voltage Decay）設(shè)計(jì)，可在獲得高轉(zhuǎn)染效率的同時(shí)，提高細(xì)胞存活率。專(zhuān)門(mén)針對(duì)難轉(zhuǎn)染的原代免疫細(xì)胞、干細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、活體動(dòng)物、受精卵以及宮內(nèi)胚胎等轉(zhuǎn)染。目前已有多篇應(yīng)用文獻(xiàn)。

論文鏈接

https://doi.org/10.1038/s41467-022-31752-z

參考文獻(xiàn)

1、Sapir, T., Kshirsagar, A., Gorelik, A. et al. Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein U (HNRNPU) safeguards the developing mouse cortex. Nat Commun 13, 4209 (2022).

2、Aylon, Y. & Oren, M. The paradox of p53: what, how, and why? Cold Spring Harb. Perspect. Med. 6, 1–15 (2016).

3、Wong, F. K. & Marin, O. Developmental cell death in the cerebral cortex. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 35, 523–542 (2019).

4、Phan, T. P. et al. Centrosome defects cause microcephaly by activating the 53BP1-USP28-TP53 mitotic surveillance pathway. EMBO J. 40, e106118 (2021).

5、 Poot, M. HNRNPU: key to neurodevelopmental disorders such as intellectual delay, epilepsy, and autism. Mol. Syndromol. 9, 275–278 (2019).

6、百度百科（baidu.com）

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