光片顯微鏡技術原理及應用

自17世紀荷蘭科學家列文虎克研制出光學顯微鏡以來，人類對于微觀世界的探索如火如荼。光學顯微鏡由于其對樣品損傷低、成像機制多等優(yōu)點，已經成為了微觀醫(yī)學研究上不可或缺的工具。隨著生物醫(yī)學領域研究不斷拓展，對于光學顯微鏡的成像速度、空間分辨率、成像質量等方面也提出了更高的要求。

目前新型顯微鏡主要有雙光子、共聚焦、光片等顯微鏡。而光片顯微鏡在近幾年飛速發(fā)展，以大視野、成像速度快、低光毒性、低光漂白等優(yōu)勢而被廣泛關注。

光片顯微鏡原理
    光片熒光顯微鏡，是一種新型的三維顯微成像技術，采用正交光路設計，用一層薄光片從側面激發(fā)樣品，并且在垂直于光片的方向上利用顯微物鏡和數(shù)字相機拍攝樣品的二維熒光圖像，通過軸向掃描光片或移動樣品逐面成像，獲取不同深度處的層析圖像最終實現(xiàn)樣品的三維重構。 光片顯微鏡的優(yōu)勢
1. 大視野、成像速度快
光片顯微鏡采用的是高QE的CCD或者sCMOS相機，可以做到面成像，大大提高了成像的速度和圖像的信噪比。工作時，光片一次曝光穿過樣品，得到的光學切片可以得到在此平面上樣品的全部信息，大大減少了成像需要的時間。
2. 低光毒性、低光漂白
光毒性是指在較長時間的強光照射下，生物樣本細胞內的熒光分子會產生分解現(xiàn)象。光漂白是指熒光成像的質量很大程度上依賴于熒光信號強度，提高激發(fā)光強度固然可以提高信號強度，但當激發(fā)光的強度超過一定限度時，光吸收就趨于飽和，并不可逆地破壞激發(fā)態(tài)分子。
光片顯微鏡與傳統(tǒng)的熒光照明技術相比，光照是從樣品的側面發(fā)出，只會照亮平面上的樣品組織，這樣光毒性可以被降低很多倍，可以在更接近生理狀態(tài)的條件下，對活體生物樣品進行長時間的三維成像。
3. 對比度高
提高了圖像和背景的反差和軸向分辨率，光片照明技術使焦平面上下的樣品不會被激發(fā)。
  樣品組織透明化
由于細胞中的色素及其它成分對光的散射和吸收，使光難以達到生物組織的深處。組織透明化技術（Tissue Clearing）是破解這一難題最重要的技術手段之一。生物組織是由不同光學特性的非均質成分組成，這會使入射光進入之后發(fā)生散射，限制光學成像的深度。對此，目前科研人員開發(fā)了三種組織透明化的方法。
①油性生物組織透明化方法
油性組織透明化主要是利用帶有高折射率介質的光學透明劑取代組織中原本的水分和脂質來平衡折射率，這種方法透明化效果較好，但是熒光蛋白容易被破壞，信號不易保存。
②水凝膠透明化方法
水凝膠方法主要是將樣品包埋在水凝膠中，使樣品中的蛋白質和核酸分子與水凝膠形成共價連接，從而起到保護和固定作用。
③水性生物組織透明化方法
由于組織中的熒光蛋白分子帶有親水基團，所以與油性透明化方法相比，水性更利于熒光信號保存，但是也存在透明時間較長、透明度差等缺點。目前分為單純浸泡透明與高水化脫脂透明兩種方法。單純浸泡是利用滲透壓的原理，將組織樣品泡在高折射率溶液中，使得組織內外被溶液被替換，從而平衡折射率。高水化法是利用氨基醇類與去垢劑類物質將樣品組織的脂質去除，然后利用水化作用降低樣品折射率實現(xiàn)組織透明化。
光片顯微鏡應用范圍
借助于光片顯微鏡，腦科學可應用于全腦神經、血管等結構三維高精度成像，用于神經退行性疾病、腦栓塞等研究；神經科學可以研究神經元神經傳導途徑及修復再生能力；呼吸科學可以用于呼吸系統(tǒng)致病及肺損傷機制、免疫應答及藥物篩選研究；腫瘤學可以用于腫瘤微環(huán)境，轉移，侵襲及藥物篩選；免疫學科也可以更完整的研究淋巴系統(tǒng)的發(fā)育過程；骨科學可以用于骨骼修復與骨再生相關研究；發(fā)育科學可以用于研究模型動物各個階段的組織與器官的發(fā)育和功能。