類(lèi)器官crispr-cas9基因編輯及慢病毒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)方法

近幾年，類(lèi)器官研究十分火熱，在信號(hào)通路機(jī)制，藥篩藥敏等研究中對(duì)類(lèi)器官模型需求激增，其中利用crispr-cas9基因編輯技術(shù)對(duì)類(lèi)器官進(jìn)行敲低或敲減來(lái)造模是個(gè)不錯(cuò)的實(shí)驗(yàn)方法，今天小愛(ài)帶大家來(lái)了解crispr-cas9基因編輯技術(shù)及慢病毒轉(zhuǎn)染方法。
 

crispr基因編輯技術(shù)中有三個(gè)最為重要的組成部分：crRNA、sgRNA和Cas9蛋白。crRNA與Cas9蛋白形成復(fù)合物，sgRNA指引（crRNA/cas9）復(fù)合物靶向目的DNA區(qū)域定向切割DNA，從而達(dá)到基因編輯的目的。

圖1 crispr-cas9基因編輯技術(shù)示意圖

crispr-cas9基因編輯技術(shù)大體上有三種技術(shù)路線：All in one質(zhì)粒轉(zhuǎn)染法，病毒轉(zhuǎn)化法，RNP復(fù)合物導(dǎo)入法。病毒轉(zhuǎn)化法是將sgRNA、crRNA和表達(dá)cas9蛋白的序列整合進(jìn)病毒中，再使用病毒感染細(xì)胞。相較于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染法，優(yōu)點(diǎn)在于sgRNA、crRNA和表達(dá)cas9蛋白可以持續(xù)存在于細(xì)胞中，從而達(dá)到一個(gè)很高的基因編輯效果。

圖2 慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞示意圖

很多小伙伴對(duì)類(lèi)器官轉(zhuǎn)染方法十分好奇，類(lèi)器官慢病毒轉(zhuǎn)染和細(xì)胞轉(zhuǎn)染大同小異，主要有以下幾個(gè)問(wèn)題需要注意：

考慮到病毒對(duì)于基質(zhì)膠的穿透性及轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染時(shí)建議將類(lèi)器官?gòu)幕�質(zhì)膠中解離出來(lái)，用適當(dāng)培養(yǎng)基重懸在孔板內(nèi)進(jìn)行。

類(lèi)器官在進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染時(shí)，消化成單個(gè)細(xì)胞來(lái)轉(zhuǎn)染效率比較高，建議消化成單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行感染。

轉(zhuǎn)染時(shí)間可根據(jù)實(shí)際實(shí)驗(yàn)情況調(diào)整，通常是轉(zhuǎn)染12-36小時(shí)，可以借鑒細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)間。

類(lèi)器官篩選不需要消化成單個(gè)細(xì)胞，在基質(zhì)膠里就可以篩選，大部分的藥物都可以穿透基質(zhì)膠，作用到類(lèi)器官上。

以下給大家整理了類(lèi)器官轉(zhuǎn)染步驟：

1）收集類(lèi)器官并消化成單個(gè)細(xì)胞后，按2×105/孔鋪到24孔板中（細(xì)胞密度可以自行摸索）；
2）用含有6μg/ml polybrene（polybrene的濃度可以自行摸索）的1ml新鮮類(lèi)器官培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基，加入適量病毒懸液，37℃孵育；
3）（對(duì)polybrene毒性敏感的細(xì)胞選作此步驟）4小時(shí)后加入1ml新鮮培養(yǎng)基以稀釋polybrene；
4）繼續(xù)培養(yǎng)12-36小時(shí)后，如有少量細(xì)胞貼壁，可用槍頭輕柔吹打下來(lái)，混勻，將細(xì)胞培養(yǎng)基混懸液收集至離心管中（一般是6-8孔為一組）。300g 4℃ 富集離心5min后移去上清，添加1ml左右類(lèi)器官傳代培養(yǎng)緩沖液（abs9730）轉(zhuǎn)移到1.5mlEP管，重新重懸離心；
5）觀察收集到的組織體積，添加25倍組織體積的基質(zhì)膠（abs9495）重懸混勻（金屬冰盒或冰上操作）；
6）以24孔細(xì)胞培養(yǎng)板為例，每孔點(diǎn)膠25ul組織基質(zhì)膠混合物進(jìn)行鋪板（金屬冰盒或冰上操作），將鋪好的培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱中10-15min成膠，添加500-750μl 類(lèi)器官培養(yǎng)基（恢復(fù)室溫）進(jìn)行培養(yǎng)；
7）待類(lèi)器官出現(xiàn)明顯增殖現(xiàn)象（一般需要2-3天），更換含有藥物的類(lèi)器官培養(yǎng)基進(jìn)行篩選（如嘌呤霉素等），沒(méi)有轉(zhuǎn)染成功的類(lèi)器官將會(huì)裂解凋亡，從而篩出成功轉(zhuǎn)染的類(lèi)器官；

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