MicroFab噴墨打印應(yīng)用于肺類器官芯片（Lung-on-a-Chip）的制備

韓國浦項(xiàng)科技大學(xué)Sungjune Jung教授團(tuán)隊(duì)使用MicroFab的按需噴墨生物打印系統(tǒng)Jetlab II，將噴墨打印與微米級別的三層肺泡組織有效地結(jié)合起來，開發(fā)了一個(gè)與人體生理結(jié)構(gòu)高度類似的肺類器官芯片模型，克服了傳統(tǒng)組織制造方法在微流控裝置中的局限性，是研究肺部病毒感染和疾病模型以及藥物分析的有效工具。

介紹
肺是呼吸系統(tǒng)的主要器官，在循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)吸入空氣和血液進(jìn)行氣體交換，肺泡直接暴露于外部環(huán)境中，使肺部容易受到細(xì)菌和病毒等病原體的感染，導(dǎo)致肺炎、結(jié)核病和肺癌等疾病的發(fā)展。對研究疾病的發(fā)病機(jī)制和藥物研究的體外肺模型的需求正在增加。傳統(tǒng)的二維細(xì)胞培養(yǎng)模型在結(jié)構(gòu)和功能上與活體肺存在差異，不適合用于診斷和治療。肺類器官芯片是一個(gè)先進(jìn)的培養(yǎng)平臺，模擬肺泡屏障的機(jī)械和結(jié)構(gòu)特性，反映其生理微環(huán)境，包括灌注和肺功能。

生物打印是一種多功能技術(shù)，可以自動制造復(fù)雜的3D結(jié)構(gòu)的組織模型。Sungjune Jung教授團(tuán)隊(duì)使用MicroFab按需噴墨生物打印系統(tǒng)Jetlab II（80μm噴頭）通過微米分辨率定位噴射皮升體積的細(xì)胞懸液，成功在微流控芯片中構(gòu)建超薄多層肺泡屏障組織， 從而使精確制造的組織在灌注下的培養(yǎng)能夠模擬人體肺部的功能。如圖1所示。
 

▲ 圖1 用于安裝包含生物噴墨打印的肺泡屏障組織的培養(yǎng)插件的微流控系統(tǒng)的示意圖。A(i) PDMS培養(yǎng)插件可安裝的生物芯片，（ii）在組織培養(yǎng)插件中噴墨打印人體肺泡活細(xì)胞，（iii）將含有活組織的培養(yǎng)插件安裝到PDMS芯片中，（iv）在安裝四個(gè)插件后向肺類器官芯片灌注培養(yǎng)基。B (i)包括流體系統(tǒng)的肺類器官芯片的橫截面示意圖和（ii）芯片上的肺泡屏障組織的橫截面示意圖。

人體肺泡屏障模型的噴墨生物打印。采用按需噴墨生物打印技術(shù)制備了四種肺泡細(xì)胞系（人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞、含有膠原的成纖維細(xì)胞和兩種類型的人肺泡上皮細(xì)胞）的微米厚三層人體肺泡屏障模型，圖2展示了整個(gè)打印過程、含有細(xì)胞的液滴高速頻閃圖像和細(xì)胞的陣列代表圖。
 

▲ 圖2 利用噴墨生物打印技術(shù)制備肺泡屏障模型。（A）肺泡屏障模型的順序打印過程示意圖。（B）壓電噴墨打印機(jī)單噴頭的自動組織打印過程的圖像。（C）噴射載細(xì)胞液滴的高速頻閃圖像。比例尺：100μm。（D）打印在基底上的6×6載細(xì)胞液滴陣列的代表性圖像。比例尺：200μm。

為了對打印的結(jié)構(gòu)特征和細(xì)胞活力進(jìn)行評估，生物打印的肺泡屏障模型在制作完成1天后植入微流控裝置，灌注培養(yǎng)7天。組織學(xué)圖像顯示膠原基底膜兩側(cè)的上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞均勻分布的三層結(jié)構(gòu)（圖3A），圖3B為生物噴墨打印肺泡屏障組織在靜態(tài)條件下的多孔板和灌注條件下的芯片中培養(yǎng)7天后的細(xì)胞活力。兩組之間在細(xì)胞活力方面的差異可以忽略不計(jì)。圖3C顯示，培養(yǎng)7天后，TEER值大幅增加，說明培養(yǎng)組織在裝置上的屏障完整性增加。采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶dUTP缺口末端標(biāo)記（TUNEL）實(shí)驗(yàn)觀察培養(yǎng)組織中的凋亡細(xì)胞（圖4D），結(jié)果表明將培養(yǎng)插件整合到微流控裝置中不會對噴墨生物打印的肺泡組織的細(xì)胞活力產(chǎn)生不良影響。
 

▲ 圖3 （A）聚碳酸酯（PC）多孔膜對肺泡屏障組織切片的H&E染色。比例尺：10μm。（B）在孔板（靜態(tài)）和微流控裝置（灌注）上培養(yǎng)的生物打印組織上，使用CCK-8實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞增殖率比較。“空白”用一個(gè)無細(xì)胞的Transwell插件進(jìn)行測試。（C）芯片上培養(yǎng)的肺泡屏障組織的TEER值測定。（D）用TUNEL檢測試劑盒處理的肺泡屏障組織的熒光圖像。凋亡細(xì)胞呈綠色，正常細(xì)胞呈紅色。比例尺：100μm。

為了分析肺泡屏障組織的功能基因，進(jìn)行了2D細(xì)胞培養(yǎng)模型和芯片上噴墨生物打印模型之間的代表性肺泡基因表達(dá)譜的比較，如圖4所示，包括表達(dá)緊密連接蛋白（ZO-1、occludin和E-cadherin）、離子通道（α-ENaC、β-ENaC和γ-ENaC）、離子輸送泵（ATP1A1）和表面活性劑蛋白（親水性SP-A和疏水性SP-B）的基因，這些基因參與肺泡屏障的關(guān)鍵功能，包括屏障形成、液體清除和表面活性劑分泌。結(jié)果表明，在芯片上噴墨生物打印的組織中，呼吸道上皮屏障的完整性得到了改善，可以更準(zhǔn)確地反映肺功能。
 

▲ 圖4 2D細(xì)胞培養(yǎng)模型和芯片上噴墨生物打印模型的代表性肺泡基因表達(dá)譜的比較。

結(jié)論
結(jié)合肺類器官芯片和噴墨生物打印技術(shù)是一種創(chuàng)新的方法，利用MicroFab按需噴墨生物打印系統(tǒng)Jetlab II開發(fā)了一種新型的肺類器官芯片平臺，并且可以植入微流控系統(tǒng)，提供ALI培養(yǎng)條件，且不均勻分布系數(shù)低（1.8%），對于人類未來在體外模擬各種器官從而對其進(jìn)行各種研究有重大意義，是研究病毒感染和疾病模型以及藥物分析的有效工具。

參考文獻(xiàn)：
[1] Kim W , Lee Y , Kang D ,et al.3D Inkjet-Bioprinted Lung-on-a-Chip[J].ACS Biomater. Sci. Eng. 2023, 9, 5, 2806–2815