TFF切向流過濾技術(shù)原理、優(yōu)勢及應(yīng)用

內(nèi)容大綱
膜過濾技術(shù)與切向流過濾
切向流過濾與傳統(tǒng)過濾方式之比較
切向流過濾濾膜形式
使用切向流過濾進行滲濾
切向流過濾應(yīng)用領(lǐng)域
附錄：如何選擇切向流過濾濾膜

膜過濾技術(shù)與切向流過濾

膜過濾技術(shù) (membrane filtration) 為廣泛使用的分離與純化技術(shù)，其作用機制是利用濾膜孔徑來篩選不同大小的分子及粒子。膜過濾技術(shù)可根據(jù)過濾分子的大小，從小分子至大分子依序分為逆滲透 (reverse osmosis, RO)、奈米過濾 (nanofiltration, NF)、超過濾 (ultrafiltration, UF)、微過濾 (microfiltration, MF)、澄清 (clarification)。 

微過濾 (MF) 與超過濾 (UF) 是運用zui廣泛的膜過濾技術(shù)。微過濾技術(shù)可過濾 0.1 ~ 10 um 的分子，如細(xì)菌等；而超過濾技術(shù)則可用以分離 0.001 ~ 0.1 um 的生物分子，如蛋白質(zhì)、病毒等。其中，超過濾技術(shù)屬于較為「溫和」的處理方式，不易造成生物分子變性 (denature) 或失活 (inactive)，使得超過濾技術(shù)在生物分子應(yīng)用上更具有優(yōu)勢。而切向流過濾 (Tangential Flow Filtration, TFF) 即為超過濾中最常使用的技術(shù)，常應(yīng)用于如分子生物學(xué) 、生物化學(xué) 、免疫學(xué)、蛋白質(zhì)化學(xué)、微生物學(xué)等生物學(xué)領(lǐng)域。 

切向流過濾與傳統(tǒng)過濾方式之比較

一般傳統(tǒng)過濾法為直流式過濾 (Direct Flow Filtration, DFF; dead-end filtration)，其樣品流垂直流動于膜表面，使小分子得以通過濾膜。然而，大分子卻容易堆積于膜表面，形成濾餅層，而隨著過濾時間增加，濾餅層厚度會隨之變厚，使得濾膜堵塞，導(dǎo)致流速、分子分離效果下降，并且縮短濾膜使用壽命。

而于切向流過濾中，樣品流則是水平流動于膜表面，并以垂直于膜表面的方向進行過濾 (即以正切角度進行過濾)，使得樣品可以隨著流速循環(huán)、同時也對膜表面進行沖洗，避免大分子堆積在膜表面并防止?jié)舛葮O化降低流速，從而維持穩(wěn)定的流速，可有效地進行過濾及延長濾膜壽命。

功能方面，切向流過濾可同時進行濃縮(concentration) 及滲濾(diafiltration)，且試驗等級與量產(chǎn)等級的切向流設(shè)備共享參數(shù)，可輕松放大生產(chǎn)規(guī)模。

綜合上述多項優(yōu)勢，在生科、生技 及生醫(yī)相關(guān)領(lǐng)域場所如醫(yī)院、藥廠等，已逐漸以切向流過濾取代傳統(tǒng)過濾法。

 

切向流過濾濾膜形式

TFF 適用多種型式的濾膜，如平板過濾膜 (flat plate)，又稱為卡匣 (cassette; capsule)；中空纖維膜 (hollow fiber; cartridge) 及螺旋狀過濾膜 (spiral wound)。目前實驗室多以使用平板過濾膜及中空纖維膜為主。

 

 

 

使用切向流過濾系統(tǒng)進行滲濾

滲濾 (diafiltration)的定義為，將樣品中可以通過濾膜的小分子，如：鹽、小分子蛋白質(zhì)、溶劑等，在樣品流流經(jīng)濾膜時，透過濾膜，自樣品流中分離，并將大分子持續(xù)循環(huán)進行濃縮的過程。滲濾常見應(yīng)用包含透析、去鹽、緩沖液置換等，而其過程又分為不連續(xù)滲濾與連續(xù)滲濾兩種。

不連續(xù)滲濾(discontinuous diafiltration)是以手動方式將水/新鮮緩沖液/稀釋液以一定體積加入樣品中，待濃縮至一定體積后再次加入緩沖液后濃縮，不斷重復(fù)上述過程至滲濾完成。
不連續(xù)滲濾時，樣品濃度持續(xù)變化、易變性，且滲透量 (流量) 會隨著樣品濃度的增加而降低。

連續(xù)滲濾(continuous diafiltration)，又稱為定容滲濾 (constant volume diafiltration) ，其過程以「與產(chǎn)生濾液的相同速度」來添加水/新鮮緩沖液/稀釋液等，來過濾掉原本溶液中的鹽類或其它小分子，因此進行連續(xù)滲濾的過程中，系統(tǒng)中總?cè)芤后w積不會改變，因此生物分子不容易被破壞結(jié)構(gòu)、產(chǎn)生變性。此外，經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)，相較于不連續(xù)滲濾，連續(xù)滲濾添加較少的緩沖液就可以達到 99 % 的分離效果。

以去鹽為例，過濾過程中是透過添加滲濾體積 (diafiltration volume, DV) 降低鹽濃度。進行連續(xù)滲濾時，直接以 5 個 DV ，即可移除達約99%的鹽分子；而在不連續(xù)滲濾時，在以手動方式每次添加1個 DV的狀況下，則必須在添加7個 DV 后，才可移除99%的鹽分子。

綜觀以上，連續(xù)滲濾被認(rèn)為相較于不連續(xù)滲濾而言，是相對「溫和」的生物分子處理過程，在生科領(lǐng)域應(yīng)用中更具有優(yōu)勢。

 

切向流過濾應(yīng)用領(lǐng)域

· 濃縮、去鹽：如蛋白質(zhì)、勝肽、核酸 (DNA, RNA) 等

· 分離、純化：如酵素、抗體、重組蛋白、病毒、疫苗等

· 緩沖液置換：如去除溶劑、透析等

· 澄清；如細(xì)胞裂解物 、組織均質(zhì)物 等

· 去熱原 ：如水、緩沖液、培養(yǎng)液等 – 須以管柱層析分析 (column chromatography) 的樣品前處理

· 細(xì)胞收集

· 濃縮病毒：濃縮溶瘤麻疹病毒 (oncolytic measles virus) 以治療末期癌癥

· 臨床醫(yī)療：血液透析 (hemodialysis)、血紅素 (hemoglobin) 純化

附錄：如何選擇切向流過濾濾膜

切向流過濾系統(tǒng)中所使用的濾膜相較于直流過濾所使用的濾膜構(gòu)造十分不同，在挑選時，建議可考慮以下幾個重點：

欲保留或移除目標(biāo)分子

厘清實驗的目的是保留或是移除目標(biāo)分子：濃縮為保留目標(biāo)分子，滲濾、去鹽、溶液置換為移除目標(biāo)分子。

目標(biāo)分子的分子量

依照目標(biāo)分子的大小，評估適用的濾膜孔徑大小，一般以截留分子量 (MWCO, NMWL)或分子直徑表示。濾膜的選擇，通常依廠家不同會選擇目標(biāo)分子分子量1/3 ~ 1/6的 MWCO，即低于目標(biāo)分子量的3~6倍，并留意欲分離的分子之間，大小至少應(yīng)相差10倍以上，以確�；旌衔镉行Х蛛x；若以分子直徑選擇濾膜，則選用濾膜孔徑 (um)小于目標(biāo)分子直徑即可。
然而，分子量及分子直徑并無直接關(guān)系，無法進行換算，因此在選用濾膜時，應(yīng)多加留意其標(biāo)示。

 

回收率的要求高/低

回收率的需求與MWCO的選擇有關(guān)：
回收率要求不高(低)：可選用 MWCO 低于目標(biāo)分子 3 倍的濾膜，其孔徑大、處理速度快。
回收率要求高：可選用 MWCO 低于目標(biāo)分子 6 倍的濾膜，其孔徑小，但處理速度較慢。
此外，濾材的選擇也會影響回收率，一般分為 PES (polyethersulfone) 及纖維素材質(zhì)，PES具有較高的樣品結(jié)合率，導(dǎo)致回收率較低；纖維素跟樣品結(jié)合率低，因此具有高回收率，針對較為珍貴的樣品，即可選用纖維素制成的濾膜。