仿生3D打印支架在脊髓損傷修復(fù)中的應(yīng)用

目前對(duì)功能組織的生物打印方法缺乏適當(dāng)?shù)纳�物制造技術(shù)來(lái)構(gòu)建復(fù)雜的三維微結(jié)構(gòu)，這對(duì)指導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)和促進(jìn)組織成熟至關(guān)重要1。中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）結(jié)構(gòu)的3D打印尚未完成，可能是由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性。在這里，我們報(bào)道了使用一種微尺度連續(xù)投影打印方法（μCPP）來(lái)創(chuàng)建一個(gè)復(fù)雜的中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)，用于脊髓的再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用。μCPP可以在1.6秒內(nèi)打印出根據(jù)嚙齒動(dòng)物脊髓尺寸定制的3D仿生水凝膠支架，并可擴(kuò)展到人類脊髓大小和病變幾何形狀。我們?cè)趪�齒類動(dòng)物體內(nèi)測(cè)試了裝載神經(jīng)祖細(xì)胞（NPCs）的µCPP 3d打印支架支持軸突再生并在完全脊髓損傷部位形成新的“神經(jīng)中繼”的能力。我們發(fā)現(xiàn)損傷的宿主軸突再生成3D仿生支架，突觸到植入設(shè)備的npc上，植入npc進(jìn)而將軸突延伸出支架和損傷下方的宿主脊髓，以恢復(fù)突觸傳遞并顯著改善功能結(jié)果。因此，三維仿生支架提供了一種通過(guò)精確醫(yī)學(xué)來(lái)促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)再生的手段。在美國(guó)，有超過(guò)50萬(wàn)人患有脊髓損傷（SCI），從而造成了巨大的心理和經(jīng)濟(jì)成本。3D打印技術(shù)允許制造個(gè)性化的支架，“適合”個(gè)體損傷的精確解剖，以刺激、引導(dǎo)和對(duì)齊軸突再生。普通的噴墨或擠壓生物打印可以創(chuàng)建簡(jiǎn)單的結(jié)構(gòu)，如軟骨或血管4，但μ CPP可以使用各種生物材料和細(xì)胞創(chuàng)建復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)5（圖1a）（圖1b）。噴墨或擠壓打印可以通過(guò)液滴或線條之間的人工界面損害機(jī)械完整性；μ CPP無(wú)層印刷結(jié)構(gòu)不顯示平面?zhèn)斡埃ń缑妫�。只�?.6秒就需要打印一個(gè)2毫米的支架（補(bǔ)充視頻1），其速率~比傳統(tǒng)的噴嘴打印機(jī)快1000×5。使用聚焦光進(jìn)行聚合，可以產(chǎn)生1 μ m的打印分辨率。我們?cè)O(shè)計(jì)了一種支持損傷后再生的大鼠脊髓支架(圖1a)。直徑200 μ m的微通道與損傷上下寄主軸突束對(duì)齊(圖1d,e)。脊髓內(nèi)部的“灰質(zhì)”區(qū)域通常在損傷部位下方?jīng)]有軸突;因此，我們將該區(qū)域做實(shí)，以增強(qiáng)結(jié)構(gòu)的完整性(圖1d)。支架的彈性模量260 – 300kpa(圖1k)，與正常脊髓(200 – 600kpa)相似6-8。

為了驗(yàn)證概念，我們打印了符合幾個(gè)不同和復(fù)雜的人類脊髓病變腔的精確形狀和尺寸的支架，包括挫傷病變（圖1F-J和補(bǔ)充圖·圖）和刀切（補(bǔ)充圖1B圖）。然后我們將支架植入T3完全脊髓橫斷的大鼠體內(nèi)。11只費(fèi)舍爾大鼠植入2毫米長(zhǎng)的3D仿生支架；11只接受3D仿生支架，由聚乙二醇-甲基丙烯酸明膠（PEGGelMA）制作的；8個(gè)對(duì)照組只接受病變；8名對(duì)照組接受無(wú)支架的大鼠NPCs；7只動(dòng)物接受含有200µm通道（瓊脂糖支架9-14）的瓊脂糖支架，以與3DPEGGelMA打印支架進(jìn)行比較。4周后，三維仿生支架的通道和實(shí)心仍保持植入前結(jié)構(gòu)，無(wú)斷裂或變形（圖2a）。由透明質(zhì)酸等其他材料組成的三維仿生支架，在4周后迅速降解和塌陷（補(bǔ)充圖2）。維持支架結(jié)構(gòu)至少4周被認(rèn)為是在病變部位保持物理支持和排列病變部位的再生軸突的必要條件。PEG-GelMa支架也具有生物相容性，表現(xiàn)出在模板瓊脂糖支架周圍形成的反應(yīng)性細(xì)胞層和顆�；�組織的顯著衰減（圖2b和補(bǔ)充圖2）。與瓊脂糖支架相比，3D仿生支架周圍的宿主反應(yīng)細(xì)胞層的厚度也減少了35%（P<0.05；圖2b，右）。通過(guò)對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的IBA1標(biāo)記顯示，支架植入并沒(méi)有加劇脊髓炎癥反應(yīng)（補(bǔ)充圖3）。重要的是，反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)被3D仿生支架修飾：在對(duì)照組病變和瓊脂糖支架的接受者中，一層反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞“包圍”了病變（圖2c，左）。相比之下，星形膠質(zhì)細(xì)胞突起被3d打印支架重新排列，不再在宿主/支架界面上形成“壁”；相反，星形膠質(zhì)細(xì)胞突起與支架的開放通道顯著地縱向重新排列，沿軸突軸穿透支架通道（圖2c，右，補(bǔ)充圖4）。此外，對(duì)宿主/病變/移植物界面總膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）免疫反應(yīng)性的定量分析顯示，與其他損傷動(dòng)物相比，植入3D仿生打印支架的動(dòng)物數(shù)量顯著降低(P < 0.05；圖2c，右）。

甲苯胺藍(lán)和RECA-1免疫標(biāo)記顯示，空支架很容易和廣泛的血管化（圖2d）。標(biāo)記為神經(jīng)絲200（NF200）的損傷宿主軸突再生成空的3D仿生支架，很容易通過(guò)宿主/支架界面。在支架壁的引導(dǎo)下，穿透支架的軸突沿脊髓吻側(cè)-尾軸線性生長(zhǎng)（圖2e，右)；這與瓊脂糖支架與宿主10、11界面上頻繁的軸突錯(cuò)位和偏轉(zhuǎn)相反(圖2e，左）。在三維仿生支架中，每個(gè)通道的神經(jīng)絲標(biāo)記再生軸突的平均數(shù)量為97 ± 8，距離吻側(cè)宿主/支架界面1 mm。宿主的5-羥色胺能軸突也能再生到支架中（圖2f，左），平均有11個(gè)±5的5-羥色胺能軸突到達(dá)支架的尾端（圖2f，右）。來(lái)自外周神經(jīng)系統(tǒng)的宿主雪旺細(xì)胞11遷移到支架中，并將許多再生的宿主軸突包裹或重新髓鞘（圖2g-i）。神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）和NPCs是促進(jìn)受損宿主軸突再生為SCIS的一種手段 。
 

圖1 | 3d打印支架模擬脊髓結(jié)構(gòu)。a、3d打印機(jī)設(shè)置:紫外光源(365 nm波長(zhǎng));一種用于分片圖像流生成和系統(tǒng)同步的計(jì)算機(jī)用于光學(xué)圖案生成的數(shù)字微鏡裝置(DMD);一套投影光學(xué)裝置;一種用于樣品位置控制的工作臺(tái);以及用于在線監(jiān)測(cè)制作過(guò)程的CCD(電荷耦合裝置)成像系統(tǒng)。b、μCPP無(wú)層3D打印創(chuàng)建無(wú)離散層結(jié)構(gòu)。在基于擠壓的3d打印方法中(左)，隨著舞臺(tái)在z軸上移動(dòng)，材料被擠壓，在水滴之間創(chuàng)建圖層。CPP印刷(右)創(chuàng)造了一個(gè)連續(xù)層結(jié)構(gòu)。完整T3大鼠脊髓軸突重鏈神經(jīng)絲(NF200)標(biāo)記。吻端在圖像的左邊，尾端在圖像的右邊。白質(zhì)(面板頂部)的軸突高度排列成平行排列，從嘴側(cè)到尾側(cè)�；屹|(zhì)中的軸突(圖底部)不是線性的。白線是白質(zhì)和灰質(zhì)之間的分界線。所插入的原理圖指示了水平截面的方向。d，脊髓中的軸突排列成包含相關(guān)功能軸突的區(qū)域(束)。運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)用綠色表示，感覺系統(tǒng)用藍(lán)色表示。C，皮質(zhì)脊髓束;Ru,rubrospinal tract;Ra, raphespinal tract;Ret，網(wǎng)狀脊髓束;Pr，本體脊髓束;ST，多巴丘腦束;DC，背柱感覺軸突。我們的支架模擬了白質(zhì)的線性組織。通道是在3D空間中精確打印出來(lái)的。e，解釋軸突排列和引導(dǎo)假說(shuō)的示意圖。受損的宿主軸突(如皮質(zhì)脊髓束(CST)、紅脊或網(wǎng)狀脊髓軸突)再生到支架中，并在通道內(nèi)與NPC衍生的軸突形成突觸，NPC神經(jīng)元依次將軸突從損傷部位下方的支架中延伸出來(lái)(綠線)，進(jìn)入病變下方的相同白質(zhì)束。由線性微通道引導(dǎo)。支架在病變部位保持其三維坐標(biāo)，與自然宿主結(jié)構(gòu)相匹配。f，人類臨床完全性脊髓損傷(ASIA A)矢狀位頸椎正中t1加權(quán)磁共振圖像。病變的前部(右側(cè))可見一小塊空閑的宿主白質(zhì)(箭頭)。圖像旁邊顯示病變的大小。g，從f繪制囊性病變空洞輪廓。h，需要3D打印的支架計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)(CAD) 3D模型，對(duì)應(yīng)于精確的病變形狀。i，打印的支架與f. j中所示的尺寸相匹配，假設(shè)適合人體挫傷腔中打印的3D支架。k，利用動(dòng)態(tài)力學(xué)分析對(duì)支架彈性模量進(jìn)行力學(xué)測(cè)量。N =3個(gè)支架試樣進(jìn)行動(dòng)態(tài)力學(xué)分析。數(shù)據(jù)為均值±s.e.m，比例尺為50 μ m(c)。

來(lái)自損傷上方的損傷宿主軸突的活性可以通過(guò)植入的神經(jīng)干細(xì)胞形成的繼電器跨損傷傳遞到損傷下方的宿主神經(jīng)元，支持功能改善1,2,15,16。以前，我們?cè)趽p傷后2周移植 NPC，因?yàn)橛捎谟卸狙�液制品和炎癥17-21，分離的細(xì)胞移植物在急性損傷部位存活不佳[1,2,15,16] ; 這些反應(yīng)在亞急性延遲后減少[18,19,22,23]。支架可以保護(hù)移植細(xì)胞，當(dāng)患者進(jìn)行脊柱減壓和穩(wěn)定時(shí)，提供了在損傷后急性干預(yù)的可能性24,25。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，我們將支架內(nèi)的神經(jīng)干細(xì)胞移植到急性 SCI損傷部位，加載表達(dá) GFP 的大鼠 NPC (n = 11只動(dòng)物; 參見方法)1,2,16。另外一組動(dòng)物在沒(méi)有支架的情況下接受NPC 移植到病變部位(n = 8只動(dòng)物)。一個(gè)月后，NPC 在每個(gè)移植動(dòng)物體內(nèi)存活并完全填滿了支架通道(圖3a 和補(bǔ)充圖5a)。神經(jīng)干細(xì)胞也存在于支架和宿主脊髓之間的界面，而沒(méi)有扭曲支架或宿主脊髓結(jié)構(gòu)(補(bǔ)充圖5a)。共有47 ± 2% 的移植 NPC 表達(dá)早期神經(jīng)元標(biāo)志物 Hu1(補(bǔ)充圖5b，f) ，20 ± 3% 表達(dá)成熟神經(jīng)元標(biāo)志物 NeuN (補(bǔ)充圖5c，f) ，21 ± 3% 表達(dá)星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物 GFAP (補(bǔ)充圖5d-f)和11 ± 2% 表達(dá)少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物 Olig2(補(bǔ)充圖5e，f)。莖狀態(tài)標(biāo)記巢蛋白沒(méi)有檢測(cè)到，如預(yù)期的移植物分化后。共有2.8% 的植入細(xì)胞標(biāo)記為分裂細(xì)胞標(biāo)記物Ki67。在接受沒(méi)有支架的鼻咽癌移植物的動(dòng)物中，一些細(xì)胞存活但總是不能填補(bǔ)病變部位，留下非常大的空隙(補(bǔ)充圖5a)。因此，使用支架將NPC 植入早期病變部位是可行的，但是沒(méi)有支架就會(huì)失敗，這與之前使用分離或?qū)嶓w細(xì)胞移植的報(bào)道一致[18-22]。支架似乎提供了一個(gè)受保護(hù)的環(huán)境，可能沒(méi)有急性炎癥介質(zhì)和活性氧物質(zhì)26。
 

 

圖2 | 3d打印空支架植入物4周的體內(nèi)表現(xiàn)。a，標(biāo)示為軸突的植入支架橫切面(NF200)。所插入的示意圖表示截面方向。b, nisl染色顯示在瓊脂糖支架(左)或PEGDA-GelMa支架(右)植入部位有反應(yīng)細(xì)胞層(箭頭)。嘴側(cè)在左邊，尾側(cè)在右邊。黑色虛線劃分了宿主脊髓與支架的界面。盒子和晶須圖顯示了平均反應(yīng)細(xì)胞層(RCL)厚度的定量。方框顯示25 – 75個(gè)百分點(diǎn)的范圍，中線是中位數(shù)。胡須顯示的四分位數(shù)范圍(IQR)是第25或75百分位值的1.5倍。*P < 0.0019(學(xué)生t檢驗(yàn))，n = 12只動(dòng)物。c，僅病變動(dòng)物(無(wú)支架)(左)、瓊脂糖支架(中)或3d打印支架(右)的GFAP免疫反應(yīng)顯示宿主神經(jīng)膠質(zhì)“疤痕”。嘴側(cè)在左邊，尾側(cè)在右邊。在3d打印的支架中，膠質(zhì)過(guò)程縱向地與通道對(duì)齊。盒須圖顯示了病變部位周圍宿主脊髓中平均GFAP強(qiáng)度的量化。這些方框顯示了25 – 75個(gè)百分點(diǎn)的范圍，中間的標(biāo)記是中位數(shù)。胡須顯示的IQR值是第25或75百分位值的1.5倍。*P < 0.0001(事后Tukey ‘s單尾方差分析)，n = 11只動(dòng)物。d, RECA-1免疫標(biāo)記顯示的支架血管化(左)和甲苯胺藍(lán)染色(星號(hào)表示血管)(右)。e，左，宿主軸突(標(biāo)記為NF200)不進(jìn)入瓊脂糖支架。對(duì)，宿主軸突進(jìn)入3d打印的支架。虛線表示病變部位吻側(cè)端宿主/支架界面。f，宿主5ht標(biāo)記的5 -羥色胺能軸突(白色箭頭)再生到空支架(左)并到達(dá)通道尾部(右)。白色虛線劃出了海峽的入口口。g，電子顯微鏡顯示通道內(nèi)的軸突(星號(hào))與相鄰的鞘狀雪旺細(xì)胞(SC)相關(guān)。h，放大的通道圖，顯示s100標(biāo)記的雪旺細(xì)胞包裹nf200標(biāo)記的軸突(箭頭)。i，電子顯微鏡下的通道顯示有髓鞘的軸突和雪旺細(xì)胞。比例尺:500 μm (a)、200 μ m (b)、100 μ m (c、e)、25 μ m (d，左)、20 μ m (d，右)、50 μ m (f)、1 μ m (g)、5μ m (h)、0.5 μ m (i)。

在加載NPCs的支架中，大量神經(jīng)纖維標(biāo)記的軸突再生(圖3b)。再生宿主軸突排列成平行的線性陣列，采用模仿完整脊髓軸突線性排列的模式(圖3b)。調(diào)節(jié)脊髓運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)的宿主血清素能軸突也能再生到加載NPCs的3D仿生支架中(圖3D)，并且在加載NPCs的支架中從支架嘴側(cè)向支架尾部線性擴(kuò)展的數(shù)量顯著增加:在有引導(dǎo)支架和npc的動(dòng)物中，每個(gè)通道平均有85±21個(gè)血清素能軸突到達(dá)病變末端并延伸到宿主遠(yuǎn)端脊髓，而在空支架中，到達(dá)病變末端的軸突少了8倍(平均11±5個(gè)軸突)(圖3g)。在無(wú)支架植入npc的動(dòng)物中，5 -羥色胺能軸突的生長(zhǎng)方向是隨機(jī)的，而不是線性的(補(bǔ)充圖5g)，且未到達(dá)病變的尾側(cè)(比較所有組，方差分析

P < 0.0322;事后的杜克;圖3g)。因此，3D仿生支架加NPC移植物顯著促進(jìn)了宿主軸突再生到損傷部位，偶爾也會(huì)在損傷部位之外(圖3e)。位于損傷宿主脊髓尾側(cè)的5-羥色胺能軸突不是移植物來(lái)源，因?yàn)橹Ъ苤械膎pc沒(méi)有5-羥色胺免疫標(biāo)記(5HT;5 -羥色胺)和5 -羥色胺能軸突沒(méi)有共同標(biāo)記GFP(補(bǔ)充圖5h)。在支架外2mm處，宿主脊髓的白質(zhì)和灰質(zhì)中檢測(cè)到血清素能軸突(附圖5i)，病變部位3.5 mm處檢測(cè)到血清素能軸突，但超出3.5 mm處檢測(cè)不到，這表明這些軸突是再生的(沒(méi)有保留)。npc衍生的軸突可被GFP標(biāo)記識(shí)別，且在通道內(nèi)豐富且線性生長(zhǎng)(圖3c)。相比之下，植入病變部位的NPC移植物在沒(méi)有支架的情況下向隨機(jī)方向延伸軸突(補(bǔ)充圖6)。植入NPC的軸突從支架向尾側(cè)和嘴側(cè)方向大量延伸至宿主脊髓(補(bǔ)充圖5j)。植入4周后，npc填充通道的軸突超微結(jié)構(gòu)分析顯示軸突的口徑和髓鞘形成的狀態(tài)，從小的、無(wú)髓鞘的軸突(< 1µm直徑)到大的軸突(1 – 3µm，圖3h)，在一些病例中，有少突膠質(zhì)細(xì)胞髓鞘化(圖3i和補(bǔ)充圖7a)。支架內(nèi)的非對(duì)稱突觸形成并包含圓形突觸囊泡，典型的興奮性突觸(圖3j) 27-29。宿主血清素能的軸突再生到通道與npc源神經(jīng)元的樹突密切相關(guān)，通過(guò)共同標(biāo)記MAP2和GFP來(lái)識(shí)別(圖3f)。
 

圖3 |加載npc的3d打印支架植入物4周的體內(nèi)性能。a，通道中充滿了表達(dá)gfp的npc。插入的原理圖指示了該圖中所有面板中水平截面的方向。b，通道的吻側(cè)入口被宿主軸突穿過(guò)(標(biāo)記為NF200 (NF));宿主軸突與移植物衍生軸突的區(qū)別在于不表達(dá)GFP。c，植入表達(dá)gfp的NSCs在支架內(nèi)延伸線性軸突。嘴側(cè)在左邊，尾側(cè)在右邊。d, 5ht標(biāo)記的宿主血清素能軸突從病變的嘴側(cè)(左)進(jìn)入充滿npc的通道，并在通道中線性再生(箭頭)。e, 5ht標(biāo)記的宿主軸突退出通道尾側(cè)，再生到病變遠(yuǎn)端宿主脊髓中(箭頭)。白線是尾管到脊髓尾管出口的分界線。f，再生到支架通道的5HT宿主軸突與植入npc的樹突(MAP2)形成同位接觸(箭頭)(標(biāo)記為GFP)。g，定量到達(dá)支架尾端的5個(gè)ht軸突的平均數(shù)量(單尾方差分析P < 0.0322，事后Tukey’s)， n = 10只動(dòng)物。這些方框顯示了25 – 75個(gè)百分點(diǎn)的范圍，中間的標(biāo)記是中位數(shù)。胡須顯示的IQR值是第25或75百分位值的1.5倍。h，在超微結(jié)構(gòu)水平上，通道內(nèi)存在不同直徑的軸突(星號(hào))，許多軸突是有髓鞘化的(M)。i，超微結(jié)構(gòu)圖像顯示少突膠質(zhì)細(xì)胞(綠色)向髓鞘化軸突發(fā)送多個(gè)過(guò)程(紅色)。j，突觸(箭頭)在通道內(nèi)的軸突和植入npc的樹突之間形成。突觸與包含圓形囊泡的突觸前扣子是不對(duì)稱的。比例尺，200 μ m (a)， 50 μ m (b)，10 μ m (c,f)， 100 μ m (d,e)，500 nm (h)， 0.2 μ m (i)， 200 nm (j)。
 

圖4 |加載npc的3d打印支架長(zhǎng)期體內(nèi)研究a-e，植入后6個(gè)月的解剖學(xué)。a，通道結(jié)構(gòu)完整，充滿了表達(dá)gfp的npc。插入的原理圖顯示了圖中所有面板中水平截面的方向，吻端在左側(cè)。b，皮質(zhì)脊髓軸突進(jìn)入支架并沿尾側(cè)方向線性延伸。c, CST軸突聚集在通道內(nèi)一個(gè)neun標(biāo)記的神經(jīng)元上，與體形成類似bouton的接觸。d, GFP軸突從支架向病變尾部宿主白質(zhì)和灰質(zhì)延伸。腹外側(cè)白質(zhì)，病變尾側(cè)2毫米。e, npc衍生的gfp標(biāo)記的軸突在灰質(zhì)宿主神經(jīng)元(標(biāo)記為NeuN)上形成興奮性接觸(VGlut2)，位于病變尾側(cè)2mm(白色箭頭)。我是，行為研究。f，完全橫斷后BBB運(yùn)動(dòng)評(píng)分(重復(fù)測(cè)量方差分析;** p < 0.0232， * p < 0.0008;均值±s.e.m, n = 10只動(dòng)物)。g，種植后6個(gè)月電生理學(xué)研究示意圖。經(jīng)顱電刺激應(yīng)用于大腦的運(yùn)動(dòng)皮層，從后肢記錄mep。h，使用3d打印、填充npc的支架的大鼠表現(xiàn)出MEP反應(yīng)，隨后再次橫切支架上方的脊髓可消除MEP反應(yīng)�？罩Ъ艿膭�(dòng)物沒(méi)有歐洲議會(huì)議員。藍(lán)色箭頭表示刺激偽影。綠線代表幾個(gè)個(gè)體刺激的平均值，用黑色表示。i，植入含npc支架的動(dòng)物MEP平均振幅顯著增大。這些方框顯示了25 – 75個(gè)百分點(diǎn)的范圍，中間的標(biāo)記是中位數(shù)。胡須顯示的IQR值是第25或75百分位值的1.5倍。(學(xué)生t檢驗(yàn);P < 0.0001, n = 10只動(dòng)物)。比例尺:250 μ m (a)、50 μ m (b)、10 μ m (c)、40 μ m (d)、5 μ m (e)。

甲苯胺藍(lán)和超微結(jié)構(gòu)分析顯示植入4周后npc負(fù)載支架內(nèi)血管形成(補(bǔ)充圖7b)。觀察到星形細(xì)胞端足與血管、周細(xì)胞和緊密連接(補(bǔ)充圖7c,d)接觸。因此，血管被開孔，血腦屏障被恢復(fù)30,31。我們進(jìn)行了長(zhǎng)期的功能研究。22只大鼠進(jìn)行T3完整橫斷，分別植入加載大鼠脊髓NPCs的3D仿生支架(n = 11)和空支架(n = 11)。另一組(n = 11)采用無(wú)支架的npc移植至急性病變部位1、2。為了使動(dòng)物數(shù)量可控，我們沒(méi)有包括只對(duì)損傷進(jìn)行控制，而且因?yàn)榭盏闹Ъ苤恢С钟邢薜乃拗鬏S突向支架的生長(zhǎng)。6個(gè)月后的解剖學(xué)分析顯示支架保留了其三維結(jié)構(gòu)（圖4A)。支架壁厚比植入前尺寸（補(bǔ)充圖8B)減少49%，反映降解緩慢。值得注意的是，NPC存活并充滿了支架通道。 相比之下，沒(méi)有支架的病變移植物不完全成活并填充病變（補(bǔ)充圖8a)，留下大的空洞。 因此，在急性SCI中植入3D打印支架可使干細(xì)胞持續(xù)存活和部位充盈，盡管急性環(huán)境是炎癥和細(xì)胞毒26。 在植入空支架的動(dòng)物中，宿主神經(jīng)絲標(biāo)記的軸突再生到支架（補(bǔ)充圖8C)中的數(shù)量相對(duì)較少(118±8)，與植入4周后觀察到的數(shù)量(97±8)相似。

在任何情況下，在植入空支架的動(dòng)物中，宿主軸突都不會(huì)在支架外再生到宿主遠(yuǎn)端脊髓中(數(shù)據(jù)未顯示)。在植入裝有npc的3D仿生支架的動(dòng)物中，移植細(xì)胞存活了6個(gè)月，并完全填充了通道(圖4a)。Nestin標(biāo)記未檢測(cè)到，提示植入NPCs成熟，Ki67標(biāo)記未檢測(cè)到，提示細(xì)胞分裂完成。在4周支架中觀察到，5ht免疫反應(yīng)軸突進(jìn)入支架(補(bǔ)充圖8d)。共87±5個(gè)血清素能軸突到達(dá)負(fù)載npc的通道尾端，并繼續(xù)向脊髓尾端再生，與植入4周后觀察到的軸突數(shù)量相似(圖3g和補(bǔ)充圖8d);這一觀察結(jié)果表明5-羥色胺能軸突向支架的再生在4周內(nèi)完成。將AAV2-RFP載體順行注射到運(yùn)動(dòng)皮層的宿主皮質(zhì)脊髓運(yùn)動(dòng)軸突也再生到負(fù)載npc的支架中(圖4b)，并延伸到支架中點(diǎn)，距離為1mm(補(bǔ)充圖8e)。皮質(zhì)脊髓軸突在支架通道內(nèi)neun標(biāo)記的神經(jīng)元上形成了推定的bouton樣結(jié)構(gòu)(圖4c)，這與之前的報(bào)道一致，即宿主皮質(zhì)脊髓軸突再生到NPC移植物中，形成移植物神經(jīng)元內(nèi)vglut1標(biāo)記的興奮性貼附1。此外，移植物來(lái)源的gfp標(biāo)記的軸突從支架投射到宿主脊髓損傷的尾側(cè)(圖4d)，與損傷部位的宿主神經(jīng)元尾側(cè)形成緊密的貼壁，與興奮性突觸標(biāo)記物VGlut2共定位(圖4e)。支架移植物衍生的軸突生長(zhǎng)到遠(yuǎn)端宿主脊髓的數(shù)量(圖4d)大大超過(guò)支架以外宿主血清素能軸突再生的數(shù)量(補(bǔ)充圖8d);這一觀察結(jié)果表明，如果存在損傷部位恢復(fù)的神經(jīng)傳導(dǎo)，很可能是由宿主軸突再生到支架、與移植物NPCs形成突觸以及NPCs衍生的軸突延伸到遠(yuǎn)端宿主脊髓的傳導(dǎo)所介導(dǎo)的。在接受無(wú)支架急性鼻鼻炎移植的動(dòng)物中，標(biāo)記有神經(jīng)絲和血清素的宿主軸突也能穿透病變部位的部分移植物填充(補(bǔ)充圖8f,g)，但軸突生長(zhǎng)的方向是隨機(jī)的，而不是在支架內(nèi)的移植物中觀察到的線性生長(zhǎng)模式(補(bǔ)充圖8f,g)。為了確定3D仿生支架是否支持運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)，使用Basso,Beattie和Bresnahan (BBB)運(yùn)動(dòng)量表32對(duì)動(dòng)物進(jìn)行了為期5個(gè)月的評(píng)估。與空支架相比，植入npc支架的動(dòng)物表現(xiàn)出顯著的功能恢復(fù)。缺乏支架的鼻咽癌移植物與植入空支架的動(dòng)物的表現(xiàn)并無(wú)差異，這表明當(dāng)移植物不能填充病變腔，且從病變嘴側(cè)延續(xù)到病變尾端時(shí)，僅存在干細(xì)胞不足以支持功能恢復(fù)(圖4f)。在支架中植入NPC的動(dòng)物的BBB評(píng)分中，功能評(píng)分的平均值為6.6±0.5分(±s.e.m.)，表明后肢每個(gè)關(guān)節(jié)的運(yùn)動(dòng)，而在空支架中為0.3±0.2分，在NPC移植物對(duì)照組為1.6±0.8分。僅反映一個(gè)關(guān)節(jié)周圍不一致的運(yùn)動(dòng)(*P < 0.0001，重復(fù)測(cè)量方差分析;個(gè)別時(shí)間點(diǎn)和事后Tukey的t檢驗(yàn);圖4f)。通過(guò)測(cè)量后肢對(duì)腦電刺激的肌源性運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位(MEPs)，我們進(jìn)一步研究了整個(gè)橫斷部位電生理傳遞的神經(jīng)傳導(dǎo)的形成(圖4g,h)33,34。3D仿生聚乙二醇雙丙烯酸酯(PEGDA) -GelMa支架植入NPCs后5個(gè)月大鼠運(yùn)動(dòng)誘發(fā)反應(yīng)恢復(fù)(MEP平均振幅270±5μ V;平均潛伏期11.3±0.7 ms)，而植入空支架的動(dòng)物表現(xiàn)出在基線噪聲范圍內(nèi)的反應(yīng)(平均MEP振幅25.1±5.7 μ V, P < 0.0001，學(xué)生雙尾t檢驗(yàn);平均潛伏期15.3±0.8 ms;P < 0.0001，學(xué)生雙側(cè)t檢驗(yàn);在C8水平(植入位點(diǎn)的吻側(cè))再次切斷脊髓導(dǎo)致后肢所有誘發(fā)電位的喪失(圖4h)，證實(shí)了新的電生理繼電器在病變部位的形成。‘這項(xiàng)研究展示了使用快速3D打印創(chuàng)建仿生中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的可行性。這些支架可以很容易地個(gè)體化和縮放到任何患者特定的病變形狀和長(zhǎng)度。雖然我們和其他人已經(jīng)注意到引導(dǎo)軸突通過(guò)病變部位10-13，35-37的重要性，但在這里我們展示了宿主軸突完全再生超過(guò)了由生物工程支架支持的嚴(yán)重的、完全的脊髓橫斷部位。此外，大多數(shù)脊髓損傷患者在手術(shù)減壓時(shí)，支架對(duì)NPCs的植入起著急性支持作用；因此，3D仿生PEGDA-Gelma支架為神經(jīng)干細(xì)胞移植損傷后早期干預(yù)提供了一種潛在的手段。再生宿主和干細(xì)胞衍生軸突的生長(zhǎng)在穿過(guò)支架時(shí)呈明顯的線性。雖然以前的研究已經(jīng)將生物工程支架引入SCI10-13，35-37位點(diǎn)，但大多數(shù)報(bào)道未能解決宿主對(duì)支架的炎癥反應(yīng)。值得注意的是，我們的pegda-gelma支架重組了損傷部位星形膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)，使宿主星形膠質(zhì)細(xì)胞與宿主軸突束的生長(zhǎng)軸一致38，而不是阻止軸突生長(zhǎng)39。這可能支持廣泛的宿主軸突再生進(jìn)入，并在5-羥色胺能宿主軸突的情況下，從病變部位進(jìn)入遠(yuǎn)端宿主脊髓。
 

References

1. Kadoya, K, et al. Spinal cord reconstitutian with homalogous neural grafts

enables robust corticospinal regeneration. Nat. Med 22,479-487 (2016).

2. Lu, E et al.Long-distance growth and connectivity of neural stem cells after

severe spinal cord injury. Cell 150,1264-1273 (2012).

3. NSCISC Annual Statistical Report – Model Systems Public Version

(National Spinal Cord Injury Statistical Center, University of Alabama at

Birmingham,2014).

4. Murphy, S. V &Atala, A.3D bioprinting of tissues and organs. Nat.

Biotechnol 32, 773-785(2014).

5. Soman, P, Chung, P.H,Zhang, A. P.& Chen,S. Digital microfabrication of

user-defined 3D microstructures in cdl-laden hydrogels.Biotchnol. Bioeng.

110,3038-3047 (2013).

6. Dalton, E D, Flynn, L.& Shoichet, M. S.Manufacture of paly(2-hydroxyethyl

methacrylate-co-methyl methacrylate) hydrogel tubes for use as nerve

guidance channds. Biomateriak 23, 3843-3851 (2002).

7. Hung, T.K, Chang, G.L,Lin, H.S,Walter, E. R.& Bunegin,L

Stress-strain rdationship of the spinal cord of anesthetized cats.J.Biomech

14,269-276(1981).

8. Tsai, E.C, Dalton,P. D,Shoichet,M.S.& Tator, C. H. Synthetic hydrogd

guidance channds facilitate regeneration of adult rat brainstem motor axons

after complete spinal cord transection. J Neurotrauma 21,789-804 (2004).

9. Kofler, J. Samara,R. E.& Rosenzweig, E.S. Using templated agarase

scaffalds to promote axon regeneration through sites of spinal cord injury.

Methods Mol. Biol 1162,157-165 (2014).

10.Gao,M.et al Templated agarose scaffolds for the support of motor axon

regeneration into sites of compkete spinal cord transection. Biomaterials 34,

1529-1536 (2013).

11.Gros,T,Sakamoto,J.S,Blesch, A,Havton, L. A.& Tuszynski, M.H.

Regeneration of long-tract axons through sites of pinal cord injury using

templated agarose scaffolds. Biomateriais 31,6719-6729 (2010).

 

References

1. Kadoya, K, et al. Spinal cord reconstitutian with homalogous neural grafts

enables robust corticospinal regeneration. Nat. Med 22,479-487 (2016).

2. Lu, E et al.Long-distance growth and connectivity of neural stem cells after

severe spinal cord injury. Cell 150,1264-1273 (2012).

3. NSCISC Annual Statistical Report – Model Systems Public Version

(National Spinal Cord Injury Statistical Center, University of Alabama at

Birmingham,2014).

4. Murphy, S. V &Atala, A.3D bioprinting of tissues and organs. Nat.

Biotechnol 32, 773-785(2014).

5. Soman, P, Chung, P.H,Zhang, A. P.& Chen,S. Digital microfabrication of

user-defined 3D microstructures in cdl-laden hydrogels.Biotchnol. Bioeng.

110,3038-3047 (2013).

6. Dalton, E D, Flynn, L.& Shoichet, M. S.Manufacture of paly(2-hydroxyethyl

methacrylate-co-methyl methacrylate) hydrogel tubes for use as nerve

guidance channds. Biomateriak 23, 3843-3851 (2002).

7. Hung, T.K, Chang, G.L,Lin, H.S,Walter, E. R.& Bunegin,L

Stress-strain rdationship of the spinal cord of anesthetized cats.J.Biomech

14,269-276(1981).

8. Tsai, E.C, Dalton,P. D,Shoichet,M.S.& Tator, C. H. Synthetic hydrogd

guidance channds facilitate regeneration of adult rat brainstem motor axons

after complete spinal cord transection. J Neurotrauma 21,789-804 (2004).

9. Kofler, J. Samara,R. E.& Rosenzweig, E.S. Using templated agarase

scaffalds to promote axon regeneration through sites of spinal cord injury.

Methods Mol. Biol 1162,157-165 (2014).

10.Gao,M.et al Templated agarose scaffolds for the support of motor axon

regeneration into sites of compkete spinal cord transection. Biomaterials 34,

1529-1536 (2013).

11.Gros,T,Sakamoto,J.S,Blesch, A,Havton, L. A.& Tuszynski, M.H.

Regeneration of long-tract axons through sites of pinal cord injury using

templated agarose scaffolds. Biomateriais 31,6719-6729 (2010).

References

1. Kadoya, K, et al. Spinal cord reconstitutian with homalogous neural grafts

enables robust corticospinal regeneration. Nat. Med 22,479-487 (2016).

2. Lu, E et al.Long-distance growth and connectivity of neural stem cells after

severe spinal cord injury. Cell 150,1264-1273 (2012).

3. NSCISC Annual Statistical Report – Model Systems Public Version

(National Spinal Cord Injury Statistical Center, University of Alabama at

Birmingham,2014).

4. Murphy, S. V &Atala, A.3D bioprinting of tissues and organs. Nat.

Biotechnol 32, 773-785(2014).

5. Soman, P, Chung, P.H,Zhang, A. P.& Chen,S. Digital microfabrication of

user-defined 3D microstructures in cdl-laden hydrogels.Biotchnol. Bioeng.

110,3038-3047 (2013).

6. Dalton, E D, Flynn, L.& Shoichet, M. S.Manufacture of paly(2-hydroxyethyl

methacrylate-co-methyl methacrylate) hydrogel tubes for use as nerve

guidance channds. Biomateriak 23, 3843-3851 (2002).

7. Hung, T.K, Chang, G.L,Lin, H.S,Walter, E. R.& Bunegin,L

Stress-strain rdationship of the spinal cord of anesthetized cats.J.Biomech

14,269-276(1981).

8. Tsai, E.C, Dalton,P. D,Shoichet,M.S.& Tator, C. H. Synthetic hydrogd

guidance channds facilitate regeneration of adult rat brainstem motor axons

after complete spinal cord transection. J Neurotrauma 21,789-804 (2004).

9. Kofler, J. Samara,R. E.& Rosenzweig, E.S. Using templated agarase

scaffalds to promote axon regeneration through sites of spinal cord injury.

Methods Mol. Biol 1162,157-165 (2014).

10.Gao,M.et al Templated agarose scaffolds for the support of motor axon

regeneration into sites of compkete spinal cord transection. Biomaterials 34,

1529-1536 (2013).

11.Gros,T,Sakamoto,J.S,Blesch, A,Havton, L. A.& Tuszynski, M.H.

Regeneration of long-tract axons through sites of pinal cord injury using

templated agarose scaffolds. Biomateriais 31,6719-6729 (2010).