3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)解析：類器官及其“肥料”細(xì)胞因子

一、類器官簡(jiǎn)介

類器官是一類基于干細(xì)胞在體外進(jìn)行3D培養(yǎng)而形成的具有一定組織結(jié)構(gòu)和功能的微型組織或器官類似物。類器官擁有與來(lái)源組織器官高度相似的組織學(xué)特征，并能一定程度上擁有該組織器官相似的生理功能。

隨著 3D 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的興起，以3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)為基礎(chǔ)的類器官培養(yǎng)技術(shù)開始成為研究熱點(diǎn)。根據(jù)新思界產(chǎn)業(yè)研究中心發(fā)布的《2021-2025年全球類器官行業(yè)深度市場(chǎng)調(diào)研及重點(diǎn)區(qū)域研究報(bào)告》顯示，2020年，全球類器官市場(chǎng)規(guī)模在5億美元左右，隨著醫(yī)療技術(shù)進(jìn)步，類器官市場(chǎng)規(guī)模將進(jìn)一步擴(kuò)張，預(yù)計(jì)2021-2026年，全球類器官市場(chǎng)規(guī)模將保持以18.2%的年均復(fù)合增長(zhǎng)率增長(zhǎng)。在國(guó)家多項(xiàng)政策的支持下，類器官的發(fā)展也進(jìn)入了“快速通道”。

表1類器官相關(guān)的支持性政

表2 國(guó)內(nèi)施行的類器官相關(guān)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

DROST團(tuán)隊(duì)[1]曾將2D細(xì)胞和類器官模型進(jìn)行了對(duì)比，發(fā)現(xiàn)類器官不僅能高度模擬體內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境，保持細(xì)胞生長(zhǎng)的空間結(jié)構(gòu)，而且能更好地代表來(lái)源組織器官的生理功能和生物學(xué)特性。目前，類器官已成功應(yīng)用于病原微生物致病模型構(gòu)建[2]、腫瘤研究[3]、臨床藥物篩選[4]、藥物研發(fā)等多個(gè)領(lǐng)域[5]，此外，新興的單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)[6]、CRISPR-Cas9 基因編輯技術(shù)更是為類器官研究提供了進(jìn)一步發(fā)展的空間[4]。

但類器官培養(yǎng)并不如普通 2D 細(xì)胞培養(yǎng)簡(jiǎn)便，其構(gòu)建成功率不僅與組織來(lái)源種類、來(lái)源組織質(zhì)量、細(xì)胞生長(zhǎng)階段等多種因素有關(guān)，還會(huì)遇到培養(yǎng)基成分復(fù)雜培養(yǎng)條件較難優(yōu)化的挑戰(zhàn)。隨著近年來(lái)各領(lǐng)域?qū)︻惼鞴倥囵B(yǎng)的重視，多種組織器官來(lái)源的類器官模型均有報(bào)道，但仍有某些類器官建模成功率低、培養(yǎng)條件不夠穩(wěn)定等問(wèn)題存在，特別是在低分化腫瘤組織來(lái)源的類器官培養(yǎng)中，其成功率明顯低于高分化腫瘤來(lái)源組織或正常組織，因此對(duì)已有類器官培養(yǎng)基相關(guān)成分進(jìn)行了解和剖析就顯得尤為重要，本文將重點(diǎn)對(duì)在類器官培養(yǎng)基中起到部分關(guān)鍵調(diào)控，如同培養(yǎng)類器官的“沃土”中的“肥料”——細(xì)胞因子進(jìn)行介紹。
 

二、類器官培養(yǎng)的“肥料”——細(xì)胞因子

成功建立類器官的關(guān)鍵，除了所需的生物材料基質(zhì)外，生長(zhǎng)因子作為細(xì)胞培養(yǎng)、增殖及分化所必需的物質(zhì)也必當(dāng)優(yōu)先考慮，從而保證類器官中的干細(xì)胞長(zhǎng)期生存的能力。通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)物生長(zhǎng)條件模擬生理組織自我更新或損傷修復(fù)過(guò)程中的干細(xì)胞巢環(huán)境，如提供基底膜基質(zhì)(即Matrigengel)并添加一系列激動(dòng)劑(如Wnt和酪氨酸激酶受體)和抑制劑(如骨形態(tài)發(fā)生蛋白/轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β)可達(dá)到上述目的。不同的生長(zhǎng)因子組合也能誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向不同的類器官細(xì)胞分化進(jìn)而獲得我們需要的類器官類型(圖1)，同時(shí)不同的細(xì)胞因子也是培養(yǎng)不同種類的類器官的關(guān)鍵物質(zhì)(圖2)。

圖1：生物化學(xué)型號(hào)誘導(dǎo)類器官形成[7]

圖2不同來(lái)源和類型的類器官對(duì)生長(zhǎng)因子偏好性[8]。

生長(zhǎng)因子的添加配方仍在不斷改進(jìn)，以進(jìn)一步提高類器官體外存活率。下面將對(duì)部分生長(zhǎng)因子進(jìn)行逐一介紹。

1. 表皮生長(zhǎng)因子（epidermalgrowth factor，EGF）：

表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子是人體內(nèi)一種重要的細(xì)胞因子，其功能主要是促進(jìn)皮膚細(xì)胞的分裂，同時(shí)表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子也可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖。在輸卵管的類器官培養(yǎng)中，表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子可以促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化[9]。此外，在小腸類器官培養(yǎng)中，表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子可以促進(jìn)腸道的生長(zhǎng)，表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子信號(hào)通路在腸類器官生長(zhǎng)中發(fā)揮重要作用[10]。此外，表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞具有促進(jìn)增殖的作用[11]。

2. 成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）：

成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子廣泛分布于體內(nèi)多種組織器官，是一種對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖以及分化具有調(diào)控作用的生長(zhǎng)因子，其家族目前發(fā)現(xiàn)23個(gè)成員。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子通過(guò)對(duì)多種信號(hào)通路發(fā)揮作用從而調(diào)控體內(nèi)細(xì)胞的生長(zhǎng)。有研究表明，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子通過(guò)抑制骨形態(tài)發(fā)生蛋白信號(hào)以及提高 Wnt 信號(hào)傳導(dǎo)從而在類器官培養(yǎng)中發(fā)揮作用[12]。而且，Sox10 可以標(biāo)記乳腺類器官培養(yǎng)的干細(xì)胞群，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子信號(hào)可以調(diào)節(jié)不同 Sox 家族轉(zhuǎn)錄因子在體內(nèi)的表達(dá)以及功能[13]。在類器官培養(yǎng)中最常見的家族成員為成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2(bFGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子7(KGF)以及成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子10。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2 可以促進(jìn)類器官的形態(tài)發(fā)生，維持胚胎干細(xì)胞的干性，也可以與胰島素樣生長(zhǎng)因子 1 結(jié)合增強(qiáng)人腸干細(xì)胞的集落形成能力，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、分化[14]。由此看出，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族對(duì)于機(jī)體內(nèi)多種細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化具有重要的調(diào)控作用，因此也成為體外類器官培養(yǎng)中較常見的細(xì)胞因子之一。

3. 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子( vascular endothelial growth factor，VEGF)：

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子是一個(gè)家族，包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 A、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 B、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 C 等多個(gè)家族成員，其主要作用為促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)。通常所提到的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子指的是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 A，也是在類器官培養(yǎng)中比較常用的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，其在血管生成和內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)中發(fā)揮作用。但在類器官培養(yǎng)中，其功能不再僅僅局限于血管生成等作用。研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 A 在腎臟類器官培養(yǎng)中可以促進(jìn)小鼠后腎間充質(zhì)細(xì)胞的增殖，而對(duì)于細(xì)胞的遷移沒有影響[15]。在心臟類器官研究中，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子信號(hào)通路通過(guò)促進(jìn)Cx43 表達(dá)，以此增強(qiáng)心臟功能[16]。在腦類器官研究中發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 A 可以促進(jìn)血管生成、神經(jīng)分化[17]。由此看來(lái)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子促進(jìn)類器官擴(kuò)增、維持內(nèi)環(huán)境平衡發(fā)揮重要作用。
 

三、植物源細(xì)胞因子

類器官行業(yè)在國(guó)內(nèi)的發(fā)展勢(shì)頭強(qiáng)勁，但是仍有一些問(wèn)題和阻礙亟待解決，首當(dāng)其沖的就是上游耗材受到限制。細(xì)胞因子作為類器官培養(yǎng)的重要調(diào)控者，是類器官培養(yǎng)基，類器官3D打印墨水等新型產(chǎn)品的重要組成部分。因此類器官的培養(yǎng)研究，到后期的批量化擴(kuò)大化的量產(chǎn)對(duì)相關(guān)耗材的產(chǎn)量與批間穩(wěn)定性都提出了很高的要求。目前，類器官產(chǎn)品的耗材(如基質(zhì)膠、維持類器官生態(tài)和分化所需的生長(zhǎng)因子、細(xì)胞培養(yǎng)板等)大都處于進(jìn)口壟斷的狀態(tài)。企業(yè)若能實(shí)現(xiàn)耗材的進(jìn)口替代，成本有望大幅下降。而禾元生物正是將打破上游供應(yīng)的國(guó)外壟斷為己任，通過(guò)利用全球首創(chuàng)的水稻胚乳細(xì)胞生物反應(yīng)器高效重組蛋白表達(dá)平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)規(guī)模化、批間穩(wěn)定性好的產(chǎn)品為類器官研究提供全方位的蛋白原料解決方案，助力中國(guó)類器官產(chǎn)業(yè)發(fā)展走到世界最前列!

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